周慧平　　唐連飛　　蔡文杰　　譚建錫　　朱中武　　禹思宇*

（1.湖南出入境檢驗檢疫局　　湖南長沙　410004；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

奶粉中陰溝腸桿菌實時熒光PCR快速檢測方法建立

周慧平1唐連飛1蔡文杰2譚建錫1朱中武1禹思宇1*

（1.湖南出入境檢驗檢疫局湖南長沙410004；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

為建立快速有效的陰溝腸桿菌檢測方法，根據(jù)Genbank中的陰溝腸桿菌Amp C酶基因序列設(shè)計引物和探針，建立了奶粉中陰溝腸桿菌實時熒光PCR快速檢測方法。結(jié)果顯示，該方法只對陰溝腸桿菌Amp C酶基因呈陽性反應(yīng)，而對其他常見非陽性菌株基因組DNA均呈陰性反應(yīng)，檢測限為20 CFU/mL，對人工污染的奶粉樣品檢測驗證了方法的實用性。建立的實時熒光PCR方法特異性強，靈敏度高，可以快速、準確檢測奶粉中污染的陰溝腸桿菌。

陰溝腸桿菌；AmpC酶；實時熒光PCR；檢測

1　　前言

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，為革蘭氏陰性粗短桿菌，能產(chǎn)生廣譜Amp C酶和β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs），是一種條件致病菌，平時廣泛分布于自然界中，于人和動物的腸道中普遍存在，既可引起食源性疾病，又是醫(yī)院內(nèi)感染和機會感染的重要致病菌［1］。在抗生素選擇性壓力下，陰溝腸桿菌的耐藥機制不斷發(fā)展，已產(chǎn)生多重耐藥性，給臨床治療帶來新的挑戰(zhàn)［2-5］。近年由陰溝腸桿菌引起嬰幼兒腹瀉的發(fā)病率有逐年增高的趨勢，作為嬰幼兒食源性疾病的致病菌，陰溝腸桿菌已引起廣泛關(guān)注。

食品中尤其是奶粉中陰溝腸桿菌的污染一直受到人們的關(guān)注。即使陰溝腸桿菌在嬰兒奶粉中含量很低，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織的專家仍認為陰溝腸桿菌引起新生兒致病的危險性越來越大，是潛在的嬰兒奶粉病原菌。因此專家們在進行嬰兒配方奶粉中致病菌的風險分析時，將陰溝腸桿菌列為“B”類危險性生物因子［6-8］。

目前對陰溝腸桿菌不論是定量還是定性檢測［9，10］，都需要經(jīng)過兩次增菌、分離和培養(yǎng)、純化，生化鑒定等長達至少5 d的檢測周期。這類方法耗時長，過程繁瑣，已無法滿足當今食品安全快速、準確的檢測要求。本研究針對陰溝腸桿菌 Amp C酶基因設(shè)計引物和探針，建立了一種快速檢測陰溝腸桿菌的實時熒光PCR方法，其靈敏度高和特異性好，能有效縮短檢測時間，為奶粉中陰溝腸桿菌的風險監(jiān)測提供新手段。

2　　材料與方法

2.1材料

2.1.1菌株

試驗用菌株來源見表1。

表1　　試驗用菌株來源

2.1.2試劑

陰溝腸桿菌分離瓊脂 （ECIA）、腸桿菌增菌肉湯、胰化大豆蛋白瓊脂：北京陸橋公司；細菌基因組小量提取試劑盒、GoTaq Probe qPCR Master Mix熒光PCR試劑盒：購自Promega公司；引物及探針：由寶生物（大連）工程有限公司合成。

2.2方法

2.2.1稀釋與計數(shù)

取陰溝腸桿菌凍干粉接種于增菌肉湯，于37℃振蕩培養(yǎng)22 h，在600 nm波長下測定培養(yǎng)液吸光度。當吸光度達到1.0時，取1 mL菌液涂胰蛋白大豆瓊脂平板進行計數(shù)（濃度單位為CFU/mL），另取1 mL菌液用作模板DNA的提取。

2.2.2DNA的提取

取陰溝腸桿菌培養(yǎng)物，按細菌基因組小量提取試劑盒說明書方法進行DNA提取。

2.2.3引物設(shè)計

以耐藥基因AmpC為檢測靶基因，在GenBank中查找不同陰溝腸桿菌AmpC基因序列，經(jīng)多序列同源性分析后找出保守區(qū)段，并以此保守區(qū)段設(shè)計引物和探針序列，用Blastn進行同源性匹配分析后確定引物和探針。上下游引物序列分別為：5’-TCAGCTGTTTGTCCGGGTTT-3’和3’-ATCATC CA G CTGCG CGAATA-5’；探針序列為：5’-FAMCAC CGA CGG CGA GAC CGA CTTT-TAMRA-3’

2.2.4反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（共 25 μL）：GoTaq Probe qPCR Master Mix（2×）12.5 μL；上下游引物（10mM）各1 μL；探針（10mM）1 μL；DNA 2 μL；ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃變性 3 s，65℃30 s，同時收集FAM熒光，共進行40個循環(huán)。

2.2.5特異性和靈敏度實驗

取標準菌株陰溝腸桿菌和大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、幽門螺桿菌，制備DNA模板分別進行熒光PCR擴增，確定檢測方法的特異性；取添加陰溝腸桿菌奶粉樣品的增菌培養(yǎng)液，平板計數(shù)法測定結(jié)果為：陰溝腸桿菌（2×108CFU/mL），作10倍梯度稀釋（菌液濃度為2×108-2），取1 mL提取DNA，再取每個稀釋度的DNA 2 μL進行熒光PCR檢測。

2.2.6樣品的檢測

參考呂敬章的方法［9］，分別無菌稱取未污染陰溝腸桿菌的嬰兒配方奶粉200 g，溶于預熱到45℃的1800mL滅菌蒸餾水中。以ATCC 23355陰溝腸桿菌標準菌株為試驗菌株，制成菌濃度為105CFU/mL的純菌液，取20 μL分別加入到已溶解的奶粉中充分混勻，制成試驗原樣。照同樣方法制作未污染陰溝腸桿菌的全脂奶粉、脫脂奶粉及嬰兒水解奶粉的試驗原樣。各取50 mL的試驗原樣，每份試驗原樣加入等體積預熱到45℃的滅菌蒸餾水，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18-22 h。應(yīng)用上述建立的陰溝腸桿菌實時熒光PCR法檢測未添加和添加陰溝腸桿菌陽性菌株奶粉樣品：嬰兒配方奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉、嬰兒水解奶粉，以評價該方法的實用性。

3　　結(jié)果

3.1實時熒光PCR特異性檢測結(jié)果

以陽性標準菌株陰溝腸桿菌和非陽性菌株 （大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、福氏志賀菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、幽門螺桿菌）制備DNA模板分別進行熒光PCR擴增，結(jié)果見圖1。

圖1　　實時熒光PCR特異性檢測結(jié)果

圖1顯示，5株陰溝腸桿菌標準菌株均出現(xiàn)典型的熒光PCR擴增曲線，而所有對照菌株（非陽性菌株）均未出現(xiàn)擴增曲線，表明建立的實時熒光PCR反應(yīng)體系適用于陰溝腸桿菌檢測，且特異性良好。

3.2實時熒光PCR靈敏度試驗結(jié)果

取添加陽性陰溝腸桿菌樣品增菌培養(yǎng)液1 mL提取DNA，作10倍梯度稀釋，取每個稀釋度（2 μL）的DNA進行熒光PCR檢測，結(jié)果見圖2。

圖2實時熒光PCR敏感性檢測結(jié)果

圖2顯示，陰溝腸桿菌液在稀釋倍數(shù)為10-7時仍然能檢測到FAM熒光信號，表明陰溝腸桿菌熒光PCR擴增體系能檢測出濃度為20 CFU/mL的陰溝腸桿菌。

3.3樣品檢測結(jié)果

應(yīng)用上述建立的陰溝腸桿菌實時熒光PCR方法檢測未添加和添加陰溝腸桿菌陽性菌株的奶粉樣品，結(jié)果見圖3。

圖3　　人工污染樣品中的熒光PCR檢測

圖3顯示：未添加陰溝腸桿菌陽性菌株的奶粉樣品均未檢測到陰溝腸桿菌FAM熒光信號；添加了陰溝腸桿菌陽性菌株的奶粉樣品均檢測到陰溝腸桿菌FAM熒光信號。說明建立的陰溝腸桿菌實時熒光PCR方法適用于奶粉樣品的快速檢測。

4　　討論

盡管人們對陰溝腸桿菌越來越重視，但對其生物學性狀、毒力、傳播途徑和流行病學仍然了解甚少。目前對陰溝腸桿菌的研究主要集中在其耐藥基因、耐藥機制和臨床分布方面［11-13］，對陰溝腸桿菌的快速檢測未見新的研究報道，實際工作中往往采用傳統(tǒng)的檢測方法：增菌培養(yǎng)、分離、用VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)和API進行生化鑒定［14-17］。這些傳統(tǒng)的檢測方法已經(jīng)不能滿足食品安全快速、準確檢測的需求，而熒光PCR技術(shù)作為快速、準確的診斷手段早已廣泛應(yīng)用于食品中致病微生物的檢測［18］。

5　　結(jié)論

本研究根據(jù)陰溝腸桿AmpC基因設(shè)計特異性引物及探針，成功建立了奶粉品中陰溝腸桿菌的實時熒光PCR檢測方法，并且經(jīng)過了實際樣品的檢測結(jié)果驗證，填補了奶粉中陰溝腸桿菌檢測方法及標準的空白。本方法具有快捷（全過程約30 h）、靈敏度高（20 CFU/mL）、特異性好的特點，適用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)督及進出口食品中病原微生物檢測等各個領(lǐng)域，可以為食品中新的致病菌檢測提供技術(shù)支持，同時為食品安全風險預警提供依據(jù)。

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Rapid Detection of Enterobacter Cloacae in Powdered Milk by Real-Time PCR

ZHOU Huiping1，TANG Lianfei1，CAI Wenjie2，TAN Jianxi1，ZHU Zhongwu1，YU Siyu1*，
（1.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha，Hunan，410004；2.Hunan Institute of Animal&Veterinary Sciences）

The specific primers and probe for the real-time PCR according to the Enterobacter cloacae Amp C nucleotide sequence were designed and real-time PCR method was established to detect DNA of Enterobacter cloacae.The results showed that Enterobacter cloacae genes were positive by real-time PCR while other common non-positive strains genomic DNA was negative.Milk powder samples of artificial pollution test the practicality of the method is validated and the detection limit of Enterobacter cloacae were20CFU/mL.Theaboveresults demonstratedthatthemethodcouldbeusedforrapidly and accurately detect the Enterobacter cloacae contamination in powdered milk with high specificity and sensitivity.

Enterobacter Cloacae；Amp C；Real-Time PCR；Detection

TS207.4

E-mail：zhouhp@hnciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：ysy2003de1@qq.com

湖南省科技計劃項目（2014SK3082）

2015-11-12