趙　川，黃光遠(yuǎn)，張夢思，李和賢，周作勇，黃慶洲

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

重慶某鱷魚館病死暹羅鱷大腸桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

趙川，黃光遠(yuǎn)，張夢思，李和賢，周作勇，黃慶洲

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

2015年4月至5月間，重慶某鱷魚館3只9歲齡暹羅鱷發(fā)病，4月21日死亡1只。發(fā)病情況：3只暹羅鱷從2014年秋季開始發(fā)生局部皮膚皸裂，并從裂口處流出黃水，4、5 d后形成淡白色潰瘍，發(fā)病期間食欲不振，不愿移動，用氨芐西林膠囊、甲硝唑粉皮膚裂口處外用，同時頭孢曲松鈉肌肉注射，幾天后稍有好轉(zhuǎn)，但不能痊愈。2015年開春后，發(fā)病更為嚴(yán)重，經(jīng)常發(fā)生皮膚皸裂潰爛，4 月18日1只發(fā)病鱷不食，臥地不動，排少量黃色惡臭稀便，4月21日死亡。剖檢可見肺高度腐敗、惡臭，心表面有大量豆腐渣樣沉積物，腸壁充血、水腫，肝腫脹，表面有少量纖維素性透出物。其他兩只發(fā)病鱷臨床癥狀相似。根據(jù)內(nèi)臟剖檢特征，疑似大腸桿菌感染，并從病死鱷肺、肝、心組織中均分離到大腸桿菌，敏感試驗(yàn)表明，分離菌對阿米卡星敏感，建議鱷魚館立刻使用該藥，用藥5 d后，情況開始好轉(zhuǎn)，2周后基本痊愈?，F(xiàn)將該鱷魚館大腸桿菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及治療情況報告如下。

1　材料與方法

1.1材料主要儀器：BA2303光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、無菌操作臺、PCR儀、DYY-8C電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)。

主要藥品：普通瓊脂培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)肉湯；細(xì)菌基因組DNA提取試驗(yàn)盒（廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司，批號：2661445）；PCR試劑盒（TaKaRa公司）；藥敏紙片（批號：121012，杭州天和微生物試劑有限公司）。

試驗(yàn)動物：昆明種普通級小鼠20只（由西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物科提供）。

1.2方法

1.2.1目標(biāo)菌分離取病死鱷魚肝、肺組織及心血分別接種于LB營養(yǎng)肉湯，置37℃、增菌培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)物劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，獲得單個菌落后進(jìn)行鑒定。

1.2.2分離菌鑒定將目標(biāo)菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、S.S.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃，恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征，同時將純培養(yǎng)疑似菌革蘭染色鏡檢。

將分離菌接種到硫化氫、葡萄糖、木膠糖等微量糖發(fā)酵管內(nèi)，同時進(jìn)行吲哚、M.R.、V-P試驗(yàn)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察產(chǎn)酸、產(chǎn)氣情況。

1.2.3分離菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及序列測定

參照劉洋等[1]方法進(jìn)行。提取分離菌DNA，以16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，比較擴(kuò)增目的基因片段大小，并將PCR產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序，登入NCBI將測得的序列在BLAST中檢索細(xì)菌同源性。

1.2.4小鼠致死性試驗(yàn)將純培養(yǎng)菌株接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水稀釋成1～2×108個菌懸液備用；每株分離菌腹腔接種5只健康小鼠0.2 mL/只，同時設(shè)5只健康小鼠注射等量無菌營養(yǎng)肉湯液作為對照。觀察并記錄小鼠在接種后72 h內(nèi)的死亡情況。

1.2.5藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法[2]進(jìn)行。

1.2.6治療方案根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇敏感抗生素對其他兩只發(fā)病鱷魚進(jìn)行治療，考慮發(fā)病及不食時間較長，建議肌肉注射肌苷、輔酶A、ATP能量合劑適量，每天1次，連用7 d，根據(jù)用藥后鱷魚活動、精神、叫聲、食欲情況判定治療效果。

2　結(jié)果

2.1分離菌株的培養(yǎng)及形態(tài)特征鱷魚肝、肺及心組織分別接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)24 h后均渾濁，分別接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落形態(tài)相似，直經(jīng)1～2.5 mm灰色半透明、表面光滑、濕潤、邊緣整齊的圓形菌落；在S.S.與麥康凱瓊脂均長出紅色、隆起、光滑、直徑1～3 mm的桃紅色菌落；革蘭染色鏡檢為紅色、兩端鈍圓的單個或成對排列的革蘭陰性短桿菌。

2.2分離菌生化試驗(yàn)從肺、心血、肝組織中分離到的3株菌生化試驗(yàn)結(jié)果基本一致，除心血株產(chǎn)酸產(chǎn)氣不同外，其他生化項(xiàng)目均相同。結(jié)果見表1。

表1　分離菌株的生化試驗(yàn)

2.3分離菌16S rRNA擴(kuò)增、測序及分析選心血分離到的菌株進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，得到單一、大小在1 500 bp左右、與目標(biāo)基因片段大小相符的條帶，而且無明顯非特異性擴(kuò)增條帶，結(jié)果見圖1。測序結(jié)果序列長度為1 500 bp，經(jīng)Blast在線比對分析，分離菌16S rRNA序列與GenBank已收錄的大腸桿菌（ATCC Escherichia coli ACN001，登錄號為 gb?CP007442.1）相應(yīng)的基因序列同源性高達(dá)99%。

1：DL Marker plus；2～3：分離菌擴(kuò)增條帶

2.4致病性試驗(yàn)從心血、肺、肝組織分離到的3株菌，分別接種小鼠后48 h內(nèi)均全部死亡，死亡率100%，從死亡小鼠肝臟中分離獲得與接種菌一致的短桿菌，而對照組小鼠72 h內(nèi)全部健康存活。

2.5藥敏試驗(yàn)分離菌對阿米卡星、卡那霉素、大觀霉素、鏈霉素、氟苯尼考敏感；而對臨床常用的沙星類及頭孢類藥物耐藥。結(jié)果見表2。

表2　分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6治療效果根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議鱷魚館獸醫(yī)將發(fā)病鱷魚隔離飼養(yǎng)，選用阿米卡星，按體重5萬單位/kg，肌肉注射，每天1次，給正在發(fā)病的其他兩只鱷魚連續(xù)用藥7 d，同時因發(fā)病鱷魚進(jìn)食極少，精神不振，使用肌苷200 mg、輔酶A10 mg、三磷酸腺苷（ATP）40 mg能量合劑混合，肌肉注射，每天1次，連續(xù)用藥7 d；結(jié)果用藥5 d后，發(fā)病鱷精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，開始恢復(fù)食欲，能進(jìn)食少量活鯽魚，開始正常活動，吼叫聲音清晰洪亮，背皮顏色恢復(fù)成黑色，與健康的同類膚色基本一致，2周后與其他健康鱷魚基本相似，飼養(yǎng)員認(rèn)為已痊愈。

3　討論

根據(jù)發(fā)病暹羅鱷臨床癥狀，分離菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)、分離菌16S rDNA序列的同源性比對結(jié)果，以及致病性特點(diǎn)，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[3]，可以判定從該病死鱷肝、心血、肺組織中分離的細(xì)菌為毒力很強(qiáng)的致病性大腸桿菌。藥敏試驗(yàn)表明，分離大腸桿菌對臨床上習(xí)慣選用的頭孢類及沙星類抗生素已產(chǎn)生耐藥，這可能是該鱷魚館長期使用頭孢類藥物治療效果不佳的原因所在，而選用敏感的阿米卡星進(jìn)行治療，很快收到了理想的治療效果，說明臨床在治療鱷魚大腸桿菌病時，必須根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理選擇，以減少耐藥菌株的形成，亦不延誤治療。

鱷魚大腸桿菌病報道較少，本文初次從西南地區(qū)人工養(yǎng)殖的發(fā)病暹羅鱷內(nèi)臟組織中分離到該致病菌的存在，其生化特征、藥物敏感性與其他地區(qū)鱷魚大腸桿菌病報道[4]存在一定差異，其血清型、毒力強(qiáng)弱、流行特點(diǎn)等有待深入研究。大腸桿菌作為一種條件性致病菌，強(qiáng)化飼養(yǎng)管理，提高鱷魚自身的免疫抗病能力，同時做好鱷魚生活場所及水體的定期消毒，是有效控制本病的關(guān)鍵，特殊是西南地區(qū)的春秋季節(jié)，水中落葉較多，氣候潮濕，溝渠流水偏少，樹葉腐敗，水體污染，細(xì)菌大量繁殖，是本病的高發(fā)季節(jié)。

[1]劉洋，王玉田，楊龍峰，等.北京某鴨場鴨疫里默氏菌與大腸桿菌混合感染的診治[J].中國獸醫(yī)雜志，2014，50（1）：32-33.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T 125-1999紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000.

[3]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學(xué)出版社，1984：146-189，238-432.

[4]陳俊敏，楊珊，趙偉，等.一例鱷魚沙門菌與大腸桿菌混合感染的診治[J].畜牧獸醫(yī)科技，2007，（32）5：22-23.

S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

0529-6005（2016）07-0103-02

205-08-26

趙川（1990-），男，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)及臨床疾病防治研究，E-mail：510390483@qq.com

黃慶洲，E-mail：hqzrc@126.com