巴翠玉，張翔宇，安俊花，趙福廣，張林波，李月紅

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布水產(chǎn)站，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；3.內(nèi)蒙古烏蘭察布農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

不同組合芽孢桿菌對鯽魚抗氧化能力的影響

巴翠玉1，張翔宇2，安俊花3，趙福廣1，張林波1，李月紅1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布水產(chǎn)站，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；3.內(nèi)蒙古烏蘭察布農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

本文旨在研究不同組合芽孢桿菌對鯽魚抗氧化能力的影響。將360尾鯽魚隨機(jī)分為四組，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組I飼喂添加枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組II飼喂添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組III飼喂添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的基礎(chǔ)日糧，3組同樣使飼料中芽孢桿菌的含量達(dá)1×106CFU/g；飼養(yǎng)45 d。結(jié)果顯示：3個試驗(yàn)組鯽魚的肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力、過氧化氫酶（CAT）活力、總超氧化物岐化酶（T-SOD）活力、總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量均高于對照組，丙二醛（MDA）含量低于對照組。其中試驗(yàn)組II，差異最顯著（P<0.05），效果最好。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可以提高抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)GSH和T-AOC的含量，降低MOD的含量，有利于提高抗氧化能力，減少傷害，提高免疫力，為微生態(tài)制劑的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌；地衣芽孢桿菌；蠟樣芽孢桿菌；鯽魚；抗氧化能力

抗生素在水產(chǎn)品內(nèi)殘留、富集，會對人體造成危害，越來越被無副作用、安全、高效的益生菌制劑所取代。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用的飼用益生菌主要有光合細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌等。2003年，我國農(nóng)業(yè)部公布了能夠用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種包括：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等[1]。抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，氧自由基的產(chǎn)生，可誘導(dǎo)細(xì)胞組分如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等的氧化損傷，危害魚類健康。提高動物體抗氧化能力對保證其功能正常和生長都有重要意義。芽孢桿菌制劑添加到一些魚蝦飼料的應(yīng)用試驗(yàn)表明，飼料中添加芽孢桿菌能顯著提高消化酶的活性和非特異性免疫反應(yīng)，促進(jìn)生長[2-4]。但現(xiàn)階段對不同組合枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌對鯽魚抗氧化能力的影響報道較少，所以本文對探討不同組合芽孢桿菌對鯽魚抗氧化能力的影響有較大意義，可為后續(xù)微生態(tài)制劑的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料鯽魚由長春市太平池水庫提供，共360尾。平均初體重為53±0.32 g。

谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、谷胱甘肽測試盒、總抗氧化能力測定試劑盒、丙二醛測試盒、過氧化氫酶測試盒、總超氧化物岐化酶測試盒、蛋白定量測試盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

枯草芽孢桿菌菌種、地衣芽孢桿菌菌種、蠟樣芽孢桿菌菌種由本實(shí)驗(yàn)室從成品微生態(tài)制劑中分離得到?；A(chǔ)飼料，購自正大永吉實(shí)業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)分組鯽魚先浸泡消毒，馴養(yǎng)7 d。選擇健康活躍、體態(tài)均勻的鯽魚360尾，隨機(jī)分為4組，分別為對照組、試驗(yàn)組I、試驗(yàn)組II和試驗(yàn)組III，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾。4組魚放入相同水環(huán)境不同魚缸中。

1.2.2飼養(yǎng)管理對照組飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組I飼喂添加枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組II飼喂添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組III飼喂添加枯草和地衣芽孢桿菌的基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)組按比例添加使飼料中芽孢桿菌的含量達(dá)到1×106CFU/g。按魚體重的3%日投餌量飼喂，每天兩次定點(diǎn)定量投餌，周期為45 d。

1.2.3取樣飼養(yǎng)結(jié)束后，停食24 h，每個重復(fù)隨機(jī)抽取10尾魚，剖檢取其肝、胰臟，稱重，放入凍存管中，液氮冷卻后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于試驗(yàn)的測定。

1.2.4樣品的制備待樣品融化后，按重量（g）：體積（mL）=1∶9的比例加入預(yù)冷的滅菌生理鹽水后勻漿，離心取上清液后稀釋成合適濃度組織勻漿，待測。

1.2.5樣品的測定各指標(biāo)的測定均用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按其說明書進(jìn)行操作。每組設(shè)3個重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)處理利用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。

2　結(jié)果

2.1不同組合芽孢桿菌對鯽魚肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的影響結(jié)果如圖1，試驗(yàn)組Ⅱ鯽魚肝胰臟中GSH-Px活性比對照組、試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ分別提高26.4%、24.9% 和16.8%，有顯著差異（P<0.05）。對照組與試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ這3組間鯽魚肝胰臟中GSH-Px活力無顯著差異（P>0.05）。

圖1　飼料中添加不同組合芽孢桿菌對鯽魚肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的影響

2.2不同組合芽孢桿菌對鯽魚肝胰臟中總超氧化物岐化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和總抗氧化能力（T-AOC）指標(biāo)的影響結(jié)果如圖2，試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ鯽魚肝胰臟中T-SOD活力與對照組和試驗(yàn)組Ⅰ有顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ的肝胰臟中T-SOD活力無顯著差異（P> 0.05）。試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ鯽魚肝胰臟中TSOD活力比對照組分別提高了56.1%、74.3%和 68.4%。試驗(yàn)組Ⅱ鯽魚肝胰臟中CAT活力比對照組、試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ分別提高80.6%、24.9% 和16.8%，有顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)組Ⅲ和試驗(yàn)組Ⅰ的肝胰臟中CAT活力均比對照組高了38.7% 和32.8%，與對照組有顯著差異（P<0.05），但是這兩組之間無顯著差異（P>0.05）。試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ的鯽魚肝胰臟中總抗氧化能力均比對照組分別提高了12.9%、44.7%和30.0%，均有顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)組Ⅱ與試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ均有顯著差異（P<0.05）。

圖2　飼料中添加不同組合芽孢桿菌對鯽魚肝胰臟中超氧化物岐化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）及總抗氧化能力（T-AOC）的影響

2.3不同組合芽孢桿菌對鯽魚肝胰臟中丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH-Px）指標(biāo)的影響結(jié)果如圖3，對照組鯽魚肝胰臟中MDA含量與試驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ均有顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)組Ⅱ與試驗(yàn)組Ⅲ無顯著差異（P>0.05）。與對照組相比3個試驗(yàn)組鯽魚肝胰臟中MDA含量均有減少，試驗(yàn)組Ⅲ減少最多，減少了32.8%。試驗(yàn)組Ⅱ鯽魚肝胰臟中GSH-Px含量與對照組、試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ均有顯著差異（P<0.05），而試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)組Ⅲ之間無顯著差異（P>0.05）。試驗(yàn)組Ⅱ鯽魚肝胰臟中GSH-Px的含量比對照組、試驗(yàn)組Ⅰ和試驗(yàn)Ⅲ分別提高了57.7%、36.5%和28.9%。

圖3　飼料中添加不同組合芽孢桿菌對鯽魚丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）指標(biāo)的影響

3　討論

GSH-Px可特異的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組中肝胰臟GSH-Px活力比對照組都有提高，只有試驗(yàn)組Ⅱ與對照組有顯著差異（P<0.05），可能是抗氧化防御系統(tǒng)其他成分的介入，使機(jī)體活性氧的濃度降低，而GSH-Px未受到明顯的影響。T-SOD能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2，CAT則將H2O2分解成H2O和O2，從而清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[5-7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3個試驗(yàn)組的肝胰臟中的T-SOD和CAT活性均比對照組高，且差異顯著（P<0.05），說明添加芽孢桿菌可使肝胰臟組織中自由基的產(chǎn)生和清除之間保持平衡，增強(qiáng)抗氧化酶防御系統(tǒng)的防御能力。T-AOC是一項(xiàng)綜合性指標(biāo)，可作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成的抑制水平的評估指標(biāo)[8]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ的肝胰臟中T-AOC指標(biāo)均與對照組有顯著差異（P<0.05），說明芽孢桿菌會保持機(jī)體自身氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡，提高魚體的抗氧化能力。GSH-Px量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素，本試驗(yàn)結(jié)果表明，3個試驗(yàn)組肝胰臟中GSH-Px含量相比于對照組均得到了不同程度的提高，試驗(yàn)組ⅡGSH-Px含量提高的最多，差異顯著（P<0.05）。MDA可以反映細(xì)胞受損傷程度以及脂質(zhì)過氧化程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[9]。3個試驗(yàn)組鯽魚肝胰臟中MDA的含量均有不同程度的減少，說明芽孢桿菌可以避免組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累，防止機(jī)體氧化應(yīng)激。

本試驗(yàn)結(jié)果與沈文英等[10]研究發(fā)現(xiàn)草魚投喂枯草芽孢桿菌，其血清和肝胰臟中T-AOC以及T-SOD和CAT活性均顯著高于對照組，而MDA含量顯著低于對照組，結(jié)論相同。說明不同組合芽孢桿菌可以提高鯽魚的抗氧化能力，進(jìn)而有利于提高魚體的免疫力，保障食品安全，增加經(jīng)濟(jì)效益。而且復(fù)合芽孢桿菌添加劑效果要好于單一的芽孢桿菌添加劑，所以在未來的微生態(tài)制劑開發(fā)中可以多向復(fù)合微生態(tài)制劑方向考慮，為水產(chǎn)微生態(tài)制劑的開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1]徐海燕，曹斌，辛國芹，等.一株芽孢桿菌的分離鑒定及其益生潛質(zhì)分析[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2012，33（3）：48-53．

[2]Shen W Y，F(xiàn)u L L，Li W F.Effect of Bacillus subtilis expressed the white spot syndrome virus envelope protein VP28 on immune response and disease resistance in Penaeus vannamei[J].Acta Hy?drobiologica Sinica，2012，36（2）：375-378

[3]Kummar R，Mukherjee S C，Prasad K P，et al.Evaluation of Ba?cillus subtilis as a probiotic to Indian major carp Labeorohita[J]. Aquaculture Research，2006，37（12）：1215-1221

[4]Aly S M，Ahmed Y A G，Aharrrb A A A，et al.Studies on Bacil?lus subtilis and Lactobacillus acidophilus，as potential probiotics，on immune response and resistance of tilapia nilotica（Oreochrio?mis nilotics）to challenge infections[J].Fish&Shellfish Immunol?ogy，2008，25（1-2）：128-136

[5]Kohen R，Nyska A.Oxidation of biological systems：Oxidative stress phenomen antioxidants，redox reactions，and methods for their quantification[J].Toxicolog Pathology，2002，30（6）：620-650.

[6]de Vries，H E，Witte M，Hondius D，et al.Nrf2-induced antioxidant protection：a promising target to counteract ROS-mediated damage in neurodegenerative disease[J].Free Radical Biology And Medicine，2008，45（10）：1375-1383.

[7]SCANDALIOS J G.Oxidative stress：molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses[J].Bra?zilian Journal of Medical and Biological Research，2005，38（7）：995-1014．

[8]Benzie I F，Strain J J.The ferric reducing abilityof plasma （FRAP）as a measure of antioxidant power[J].Analytical Biochem?istry，1996，239（1）：70-76．

[9]Carsten G K，Miehaela A，Christine L，et al.Reduced expression of the inducible nitric oxide synthase after infection with Toxo?plasma gondii facilitates parasite replication in activated murine macrophages[J].International Joumal for Parasitology，2003，33 （8）：833-844．

[10]沈文英，李衛(wèi)芬，梁權(quán)，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2011，23（5）：881-886．

S963.76

B

0529-6005（2016）07-0105-03

2015-11-12

國家自然科學(xué)基金（30972191）；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目（2014Z34）；吉林省留學(xué)回國人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201523）

巴翠玉（1992-），女，碩士生，主要從事分子病原微生物學(xué)與分子免疫學(xué)研究，E-mail：bacuiyu@163.com

李月紅，E-mail：liyhong@sina.com