丁　紅，千年松，楊　凡，張鵬飛，王艷榮，戴廣海

(1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032)

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上調(diào)miR-200c表達對人肝癌干細胞化療耐藥性的影響

丁紅1，千年松1，楊凡2，張鵬飛1，王艷榮1，戴廣海1

(1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032)

目的觀察人肝癌干細胞中miR-200c的表達改變對化療藥物敏感性的影響。方法利用流式細胞分選技術(shù)從MHCC97人肝癌細胞系中分離出肝癌干細胞。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-200c mimics到肝癌干細胞；采用實時熒光定量RT-PCR對轉(zhuǎn)染miR-200c mimics前后肝癌干細胞中miR-200c表達水平進行檢測；通過噻唑藍(MTT)法檢測miR-200c對肝癌干細胞藥物敏感性的影響。結(jié)果肝癌干細胞中miR-200c的相對表達量為0.17±0.02，轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后肝癌干細胞中miR-200c的相對表達量為1.24±0.28，轉(zhuǎn)染前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染前5-氟尿嘧啶 (5-Fu)和阿霉素(ADM)對肝癌干細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為22.74 mg/L和9.56 mg/L，轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后5-Fu和ADM對肝癌干細胞的IC50分別為12.63 mg/L和3.51 mg/L，轉(zhuǎn)染前后比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論上調(diào)人肝癌干細胞中miR-200c的表達可以增強肝癌干細胞的化療敏感性，具有逆轉(zhuǎn)其化療耐藥的作用。

肝癌；腫瘤干細胞；miR-200c；化療耐藥性

腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)學(xué)說認為，腫瘤干細胞自身所具有的多藥耐藥特性是導(dǎo)致惡性腫瘤對化療藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移的“罪魁禍首”[1-2]。microRNA(miRNA)為在真核細胞生物體中廣泛存在的非編碼小分子單鏈RNA，其能夠調(diào)控腫瘤細胞中多個耐藥基因的表達，因而其參與腫瘤多藥耐藥性的具體機制也成為目前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點[3]。miR-200c是近年來發(fā)現(xiàn)的一個與腫瘤形成、腫瘤進展和化療耐藥有關(guān)的miRNA[4]。然而miR-200c是否參與調(diào)控肝癌干細胞的化療耐藥性，目前尚未見相關(guān)研究報道。本研究從肝癌細胞中分選出肝癌干細胞，通過轉(zhuǎn)染miR-200c mimics上調(diào)肝癌干細胞miR-200c的表達，觀察miR-200c對肝癌干細胞耐藥性的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　實驗資料

1.1主要材料與試劑人肝癌細胞MHCC97購自上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所；四甲基偶氮唑藍(MTT)和熒光染料Hoechst33342購自Sigma公司；DMEM F12培養(yǎng)基、小牛血清購于Gibco公司；TaqMan MicroRNA Assay、mirVana RNA Isolation Kit和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit購自美國Ambion公司；Prism?7300實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。miR-200c、U6引物及miR-200c mimics購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將MHCC97細胞接種于DMEM F12 培養(yǎng)液(10%小牛血清+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL鏈霉素)中，放入細胞培養(yǎng)箱中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2肝癌干細胞的分選將MHCC97細胞制成單細胞懸液并調(diào)整細胞密度為1×109L-1，分為2組，分別加入熒光染料Hoechst33342和維拉帕米至終濃度分別為6 mg/L和50 mmol/L。在Advantage II型流式細胞儀上，選擇355 nmUV激光發(fā)射源進行檢測，根據(jù)細胞二維散點圖形態(tài)及參數(shù)分選出邊緣群細胞即為肝癌干細胞。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染將分選后的肝癌干細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h(細胞融合度達60%左右)后，按脂質(zhì)體Lipofectamine2000說明進行SP細胞miR-200c mimics的轉(zhuǎn)染。待細胞轉(zhuǎn)染48 h后采用RT-PCR檢測細胞miR-200c表達水平。miR-200c mimics序列： 5’-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGA-3’。

1.2.4實時熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染48 h采用mirVana RNA Isolation Kit和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit并按說明進行細胞總RNA及miRNA的提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：1×mirVanaRT Primer 1 μL，mirVana5×RT Buffer 2 μL，Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL，25 ng RNA，加無RNA酶水至總體積10 μL。PCR擴增體系：Taqman MicroRNA Assay(20×) 1 μL，Product from RT reaction 1.33 μL，Taqman 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，加無RNA酶水7.67 μL至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s共40個PCR循環(huán)。RT- PCR數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCT法進行分析。U6 snRNA引物序列：上游為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-200c引物序列：上游為5’-GGTAATACTGCCGGGTAAT-3’，下游為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。

1.2.5MTT實驗將分選后的肝癌干細胞按5×104/孔接種于96孔板中，每孔100 μL。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分為5-氟尿嘧啶 (5-Fu)組、阿霉素(ADM)組和空白對照組。配制不同濃度的含5-Fu和ADM化療藥物的細胞培養(yǎng)基，然后每孔分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基100 μL，每個藥物不同濃度分別設(shè)置6個復(fù)孔；同時設(shè)置無藥物干預(yù)的細胞對照組和無細胞的空白對照組。繼續(xù)孵育細胞24 h 后，加入20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h后去除培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩反應(yīng)10 min。置于全自動酶標(biāo)儀中，設(shè)定波長為490 nm，讀取各孔吸光度(A)值，重復(fù)3次，計算半數(shù)抑制劑量(IC50)。

2　結(jié)　　果

2.1肝癌干細胞分選情況利用流式細胞分選技術(shù)分離純化肝癌干細胞，流式細胞儀二維參數(shù)圖左下角兩種熒光均陰性或很弱的區(qū)域即為肝癌干細胞，結(jié)果顯示肝癌干細胞約占肝癌細胞總數(shù)的1.94%。

2.2轉(zhuǎn)染miR-200c mimics前后肝癌干細胞miR-200c表達量轉(zhuǎn)染前，肝癌干細胞中miR-200c的相對表達量為0.17±0.02，轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后肝癌干細胞中miR-200c的相對表達量為1.24±0.28，轉(zhuǎn)染前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。

2.3轉(zhuǎn)染miR-200c mimics前后肝癌干細胞耐藥性情況轉(zhuǎn)染前5-Fu和ADM對肝癌干細胞的 IC50分別為22.74 mg/L和9.56 mg/L，轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后5-Fu和ADM對肝癌干細胞的IC50分別為12.63 mg/L和3.51 mg/L，轉(zhuǎn)染前后比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，提示增強肝癌干細胞miR-200c的表達能夠增加肝癌干細胞對化療藥物的敏感性。

3　討　　論

miRNA是廣泛存在于真核細胞生物體中的具有高度保守序列的小RNA。其作用機制主要在于抑制靶基因的翻譯或直接降解靶基因mRNA。目前的研究證實，miRNA可以調(diào)節(jié)約30%人類基因的表達和翻譯[5]。尤其值得關(guān)注的是，研究人員在miRNA研究過程中發(fā)現(xiàn)miRNA能夠通過調(diào)控耐藥相關(guān)相關(guān)靶基因的表達，進而影響其信號通路，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的耐藥性發(fā)生改變。如miR-328作用于轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2的3’-UTRs，通過抑制ABGG2的表達來提高腫瘤細胞的化療敏感性[6]；miR-125b通過調(diào)控腫瘤耐藥基因Bcl-2 和ABCC4的表達來影響腫瘤細胞的耐藥性[7]。由于miRNA在調(diào)控腫瘤細胞耐藥性上的作用至關(guān)重要，且miRNA具有內(nèi)源性和調(diào)控多個下游靶基因表達的特性，因而，通過調(diào)控腫瘤細胞中相關(guān)耐藥miRNAs的表達，理論上具有比調(diào)控單個普通耐藥基因具有更好的效能。

隨著腫瘤領(lǐng)域中干細胞機制相關(guān)研究的不斷深入，CSCs是腫瘤形成和進展的始作俑者這個觀點已得到醫(yī)學(xué)界的廣泛認同。大量的研究證實，CSCs具有天然耐藥性是導(dǎo)致目前化療藥物治療腫瘤失敗的關(guān)鍵所在[8]。CSCs對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)機制十分復(fù)雜，尚待進一步研究。目前已知與其腫瘤細胞膜表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白、增強的抗DNA損傷及修復(fù)能力、抗凋亡基因表達增強等機制有關(guān)[9-10]。雖然隨著臨床上新型化療藥物的不斷研發(fā)和應(yīng)用，能夠很大程度上殺死腫瘤細胞。但是由于CSCs具有的天然耐藥性使其很難被化療藥物完全消滅，殘存的CSCs則會導(dǎo)致化療后腫瘤復(fù)發(fā)[11]。因此，針對CSC的化療耐藥特性機制進行靶向性的研究對于提高化療效果至關(guān)重要。本次研究采用流式熒光分選技術(shù)這一目前公認的腫瘤干細胞分選技術(shù)從肝癌細胞系中分選出的肝癌干細胞，總體約占所有肝癌細胞總數(shù)的1.94%，這一結(jié)果與相關(guān)文獻報道數(shù)據(jù)是一致的[12]。

miR-200c屬于miR-200家族成員，通過調(diào)控細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，以及KRAS、ZEBl等基因的功能和表達，進而調(diào)控腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡[13-14]。此外，有研究數(shù)據(jù)顯示[15]，在培養(yǎng)的針對多柔比星耐藥乳腺癌細胞株中miR-200c的表達較敏感株中明顯下調(diào)，其可能的機制在于miR-200c能調(diào)控酪氨酸激酶受體B(TrkB)和Bmi-1的表達，進而影響乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性。本次研究我們通過人工合成miR-200c mimics并成功轉(zhuǎn)染肝癌干細胞后能導(dǎo)致肝癌干細胞miR-200a表達明顯升高。進一步通過耐藥實驗發(fā)現(xiàn)：上調(diào)人肝癌干細胞中miR-200c的表達后，肝癌干細胞對5-Fu和ADM的IC50較干預(yù)前明顯降低。以上結(jié)果表明，上調(diào)肝癌干細胞中miR-200c的表達能夠提高其對化療藥物的敏感性。后續(xù)實驗中，我們可通過生物學(xué)實驗確定miR-200c的靶基因，進一步研究其在腫瘤耐藥中的具體調(diào)控機制，為克服和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥研究提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

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Influence of miR-200c up-regulation on chemotherapy resistance of liver cancer stem cells

DING Hong1, QIAN Niansong1, YANG Fan2, ZHANG Pengfei1, WANG Yanrong1, DAI Guanghai1

(1.General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; 2.Xijing Hospital of The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

Objective It is to observe the influence of miR-200c up-regulation on the characteristics of chemotherapy resistance of liver cancer stem cells.Methods Liver cancer stem cells were isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS) from MHCC97 cell line of human hepatocellular carcinoma.The miR-200c mimics were transfected into liver cancer stem cells by liposome.The expression levels of miR-200c in liver cancer stem cells were measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).MTT method was used to evaluate the chemotherapy resistance of liver cancer stem cells.Results The expression of miR-200c in liver cancer stem cells was 0.17±0.02 before transfection, and was 1.24±0.28 after transfection, there was significant difference between before and after transfection (P<0.05).The half inhibition concentration (IC50) of 5-fluorouracil (5-Fu) and adriamycin (ADM) were 22.74 mg/L and 9.56 mg/L respectively before transfection on liver cancer stem cells, and were 12.63 mg/L and 3.51 mg/L respectively after transfection, there was significant difference between before and after transfectin (all P<0.05).Conclusion Up-regulation of the miR-200c expression in liver cancer stem cells can enhance the chemotherapy sensitivity on liver cancer stem cells; it has the effect of reversing the chemotherapy resistance.

hepatocellular carcinoma; cancer stem cell; miR-200c; chemotherapy resistance

丁紅，女，醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤的臨床治療與基礎(chǔ)研究。

戴廣海，E-mail:daigh60@sohu.com

北京市科技新星資助計劃(xx2013107)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.24.002

R-33

A

1008-8849(2016)24-2626-03

2016-03-30