張子陽，譚州科，曹明燕，楊亦彬

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腎病風(fēng)濕科，貴州 遵義 563003）

·論著·

促血管生成素重組腺病毒對糖尿病鼠腎血管新生的影響*

張子陽，譚州科，曹明燕，楊亦彬

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腎病風(fēng)濕科，貴州 遵義 563003）

目的通過SD大鼠糖尿病腎?。―N）模型，觀察經(jīng)腺病毒外源性表達(dá)Ang-1對腎臟血管新生的作用，以期為DN的臨床治療提供參考。方法SD大鼠DN造模選用鏈脲佐菌素（STZ），設(shè)計(jì)兩個(gè)大的組別，即正常對照組和DN模型組，并將DN模型組進(jìn)一步劃分為3個(gè)亞組，即糖尿病組、空白載體組、Ang-1腺病毒組。STZ造模成功后的第8周開始，從尾靜脈注入Ang-1腺病毒載體以及空白載體，在8、12、20和28周，檢測各組大鼠的尿蛋白水平，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈法分析腎臟Ang-2 mR NA水平。結(jié)果①DN模型組大鼠的尿蛋白水平較正常對照組升高（P＜0.01），且只有在20周前，空白載體組及糖尿病組的尿蛋白水平才低于Ang-1腺病毒組（P＜0.01）；②在正常對照組大鼠腎組織中未檢測到尿蛋白和Ang-2 mR NA表達(dá)，而其他DN模型組（糖尿病、空白載體、Ang-1腺病毒組）大鼠12周后的尿蛋白和Ang-2 mR NA表達(dá)升高，特別是Ang-1腺病毒組升高（峰值在20周）更為明顯（P＜0.05），在28周時(shí)降低，糖尿病、空白載體和Ang-1腺病毒組的Ang-2 mR NA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；③Ang-2與尿蛋白排泄量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.601，P＜0.05）。結(jié)論外源性給予Ang-1對糖尿病腎臟新生微血管生成有保護(hù)作用。

促血管生成素；糖尿病腎?。谎苌?；腺病毒載體

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）屬于糖尿病嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致患者發(fā)生終末期腎臟病的重要原因［1］。研究表明，糖尿病腎病患者的血管調(diào)控因子普遍存在表達(dá)異常，患者的腎小球中存在新生血管［2］，糖尿病腎病的發(fā)生與微血管病變密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［3］。如何減少血管內(nèi)皮損傷和促進(jìn)修復(fù)已成為研究熱點(diǎn)［4］。促血管生成素-1（A n g iopoietin-1，A n g-1）是近年來發(fā)現(xiàn)的促血管生長細(xì)胞因子，有促血管發(fā)生以及組織修復(fù)的重要功能，同時(shí)也有抗炎、緩解血管滲漏、抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等作用，越來越受到研究者的關(guān)注。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A n g-1下調(diào)可能導(dǎo)致糖尿病腎病后期新生血管消失［5］，本實(shí)驗(yàn)通過給予糖尿病大鼠A n g-1腺病毒載體，觀察其28周的尿蛋白、腎臟促血管生成素-2（A n g iopoietin-2，A n g-2）m R N A和蛋白表達(dá)變化，評估A n g-1對糖尿病大鼠腎臟新生血管的影響。

1　材料與方法

1.1研究動(dòng)物

本研究動(dòng)物為南京模式生物研究所購買的雄性S pra g u e-Da w ley大鼠，共140只。

1.2研究方法

1.2.1構(gòu)建Ang-1腺病毒載體A n g-1腺病毒載體由大連寶生物工程有限公司構(gòu)建，滴度為2.5× 1010p fu/ml。

1.2.2造模和分組采用鏈脲佐菌素（S trepto z otocin，S T Z）（55m g/k g）腹腔注射復(fù)制糖尿病模型，連續(xù)3 d血糖≥16.65mmol/L示造模成功。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為：①A n g-1腺病毒組。造模完成后8周，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及參考文獻(xiàn)［6］決定A n g-1腺病毒的實(shí)際注射量，本研究采用4×1011p fu/ml；②空白載體組，與A n g-1腺病毒同病毒低毒的陰性對照組，注射劑量同A n g-1腺病毒；③糖尿病組，腹腔注射S T Z造模，劑量為55m g/k g；④正常對照組，不做處理。分組完成后的第8、12、20和28周，每組分別選擇6只大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察及分析，每組35只。

1.2.3樣品處理于實(shí)驗(yàn)的第8、12、20和28周腹腔注射麻醉，取部分腎組織（兼顧皮、髓質(zhì)）迅速放入液氮中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用；另取部分腎組織置于4%多聚甲醛液固定，24 h后轉(zhuǎn)入95%酒精溶液中，并進(jìn)行后續(xù)的梯度脫水、石蠟包埋和切片處理。

1.2.424 h尿蛋白定量檢測采用7150型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）進(jìn)行24 h尿蛋白定量檢測。

1.2.5腎組織Ang-2、血栓調(diào)節(jié)蛋白（T hro m bom odul in-1，T M-1）檢測采用免疫熒光鏈霉親和素-生物素復(fù)合物-異硫氰酸熒光素法檢測腎組織A n g-2、血栓調(diào)節(jié)蛋白，按說明書及參考文獻(xiàn)操作步驟操作。

1.2.6腎組織Ang-2 mR NA檢測R N A提取及純化按說明書及參考文獻(xiàn)操作步驟操作。引物采用P R IM E R 5軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)上海生物工程有限公司合成。β肌動(dòng)蛋白（β-actin）的正向引物：5'-GG A G A TT A C T GCCC T GGC T CC T A-3'，反向引物：5'-G A C T C A T CG T A C T CC T GC TT GC T G-3'；A n g-2正向引物：5'-C T CC T G T G A GC A T C T GGG AA C-3'，反向引物：5'-GCG GGC AAAA T C A G T A GC A-3'。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)比較用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.124 h尿蛋白

①正常對照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（與8周比較：t12周=0.256，P12周= 0.800；t20周=0.198，P20周=0.844；t28周=1.686，P28周= 0.100）。②各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的24 h尿蛋白經(jīng)重復(fù)測量方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.731，P=0.005）。與正常對照組比較，A n g-1腺病毒組、空白載體組和糖尿病組不同時(shí)間點(diǎn)的尿蛋白均高于正常對照組（t8周=15.122、15.298和45.559，P8周=0.000、0.000 和0.000；t12周=17.928、19.904和16.962，P12周=0.000、0.000和0.000；t20周=32.680、19.904和28.918，P20周= 0.000、0.000和0.000；t28周=21.090、20.685和28.222，P28周=0.000、0.000和0.000）。A n g-1腺病毒組尿蛋白在第12周后逐漸減少，在第20周以后低于空白載體組（t20周=5.002，P20周=0.000）和糖尿病組（t20周=2.682，P20周=0.010），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖1。

2.2腎臟Ang-2 m RN A及Ang-2水平（灰度值）

2.2.1Ang-2 mR NA表達(dá)①各組大鼠腎組織A n g-2 m R N A經(jīng)重復(fù)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.981，P=0.020）。②A n g-2 m R N A在正常對照組中不表達(dá)；其余3組A n g-2 m R N A表達(dá)在12周開始上調(diào)，峰值均在20周。A n g-1腺病毒組A n g-2 m R N A表達(dá)普遍上調(diào)，其中在12、20和28周時(shí)A n g-2 m R N A表達(dá)高于空白載體組（t12周=22.718，P12周=0.000；t20周= 14.406，P20周=0.000；t28周=7.659，P28周=0.000）和糖尿病組（t12周=23.197，P12周=0.000；t20周=13.201，P20周= 0.000；t28周=24.882，P28周=0.000）；另外，在不同時(shí)間點(diǎn)，空白載體組的A n g-2 m R N A表達(dá)與糖尿病組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t12周=0.642，P12周=0.262；t20周= 1.645，P20周=0.052；t28周=0.254，P28周=0.400）。見表2和圖2。

表1　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白比較

表1　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白比較

組別2 8周正常對照組　1 2 . 1 2 ± 1 . 3 8 　1 2 . 2 3 ± 2 . 1 4 1 2 . 2 3 ± 2 . 9 8 1 2 . 8 7 ± 2 . 2 4 A n g -1腺病毒組5 2 . 3 3 ± 1 5 . 6 7 6 6 . 8 3 ± 1 7 . 8 9 5 7 . 1 7 ± 7 . 5 7 　4 0 . 5 0 ± 7 . 4 2空白載體組　5 2 . 2 3 ± 1 5 . 4 5 7 0 . 3 1 ± 1 7 . 1 3 6 8 . 5 5 ± 1 1 . 1 3 7 1 . 5 4 ± 1 6 . 6 3糖尿病組　3 9 . 2 4 ± 3 . 2 4 5 7 . 1 5 ± 1 5 . 5 2 6 6 . 0 1 ± 1 4 . 2 1 7 5 . 8 0 ± 1 3 . 0 0 8 周1 2 周2 0 周

圖1　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白變化趨勢

表2　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織Ang-2 m RN A表達(dá)比較

表2　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織Ang-2 m RN A表達(dá)比較

組別2 0 周2 8周正常對照組　-　-　-A n g -1腺病毒組　2 . 3 4 ± 0 . 4 8 　4 . 7 9 ± 1 . 5 1 　1 . 1 9 ± 0 . 2 0空白載體組　0 . 4 2 ± 0 . 1 4 　1 . 2 1 ± 0 . 3 5 　0 . 2 6 ± 0 . 6 9糖尿病組　0 . 4 0 ± 0 . 1 2 　1 . 3 4 ± 0 . 3 1 　0 . 2 3 ± 0 . 1 1 1 2 周

圖2　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織Ang-2 m RN A表達(dá)變化趨勢

表3　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Ang-2水平（灰度值）比較

表3　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Ang-2水平（灰度值）比較

組別2 8周正常對照組　-　-　-A n g -1腺病毒組　5 1 . 2 5 ± 1 . 2 3 　9 5 . 2 1 ± 2 . 2 4 　4 2 . 1 1 ± 0 . 7 2空白載體組　3 9 . 8 0 ± 0 . 7 2 　7 9 . 3 3 ± 1 . 0 3 　3 5 . 0 9 ± 0 . 7 3糖尿病組　4 0 . 1 2 ± 1 . 4 1 　6 9 . 7 9 ± 1 . 6 2 　3 6 . 3 6 ± 0 . 9 0 1 2 周2 0 周

圖3　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Ang-2水平（灰度值）變化趨勢

2.2.2Ang-2水平（灰度值）①各組大鼠腎組織A n g-2水平灰度值，經(jīng)重復(fù)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.751，P=0.001）。②正常對照組未發(fā)現(xiàn)A n g-2熒光表達(dá)，其余3組在第12周后腎小管周圍出現(xiàn)熒光，A n g-1腺病毒組熒光強(qiáng)于空白載體組（F12周=1.685，t12周=48.222，P12周=0.000；F20周=1.440，t20周= 38.662，P20周=0.000；F28周=1.440，t28周=41.096，P28周= 0.000）和糖尿病組（F12周=1.632，t12周=35.705，P12周= 0.000；F20周=1.861，t20周=55.195，P20周=0.000；F28周= 1.341，t28周=29.515，P28周=0.000）。見表3和圖3、4。

2.3指標(biāo)的相關(guān)性分析

尿蛋白和A n g-2的測定結(jié)果表明，A n g-2熒光灰度值與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)（t=28.507，r=-0.601，P= 0.000）。見圖5。

圖4　3組大鼠腎組織Ang-2表達(dá)熒光圖 （20周，×200）

圖5　Ang-2熒光灰度值與尿蛋白散點(diǎn)圖

3　討論

慢性腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其中慢性缺氧以及微血管病變起重要作用，可誘發(fā)腎臟周圍血管調(diào)控因子失衡及微血管結(jié)構(gòu)受到破壞，同時(shí)與微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷及修復(fù)也有密切關(guān)系。近年來，慢性疾病藥物開發(fā)及治療的熱點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向治療血管生成。目前，慢性腎臟疾病重要的病因?yàn)樘悄虿∧I病相關(guān)的慢性進(jìn)展性腎臟疾病。研究表明，該病患者的腎臟微血管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，且與管周毛細(xì)胞的缺少存在緊密關(guān)系［7］。血管新生是指從原有的血管上以發(fā)芽或嵌入的方式形成新的毛細(xì)血管的過程［8］。一般認(rèn)為A n g-1具有保持血管穩(wěn)定和完整性、調(diào)節(jié)血管功能的作用，而A n g-2使血管的穩(wěn)定性消失，主要表達(dá)在血管修復(fù)時(shí)的血管［9-10］，并涉及血管病變級炎癥性疾病的病理生理過程［11］。

A n g是一種能夠針對血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的細(xì)胞因子，能夠?qū)π律艿纳杉跋嚓P(guān)調(diào)控發(fā)揮重要作用。從種類進(jìn)行分類，A n g家族可以分為4個(gè)亞類，即A n g-1、A n g-2、A n g-3及A n g-4，內(nèi)皮細(xì)胞Tie-2受體可與這4類因子結(jié)合并發(fā)揮生理功能。其中，A n g-2是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，與促血管生成素受體Tie-2結(jié)合后較為特殊，即不產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)而發(fā)揮對A n g-1競爭性抑制作用，是啟動(dòng)血管再次重構(gòu)的主要因子，在血管新生的后期尤其血管的構(gòu)建、成熟與穩(wěn)定需要A n g-2家族的參與。A n g-2是內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的自分泌調(diào)節(jié)因子。有實(shí)驗(yàn)表明，在高血糖情況下，A n g-2在心臟及視網(wǎng)膜等內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，并使血管受損傷級內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［12］。

本實(shí)驗(yàn)中作者采用重組腺病毒A n g-1干預(yù)后發(fā)現(xiàn)A n g-1腺病毒組A n g-2 m R N A和蛋白表達(dá)較糖尿病和空白載體組上調(diào)。A n g-1可通過募集血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞重塑血管，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和修復(fù)，形成完整、功能正常的血管網(wǎng)，是維持成熟血管穩(wěn)定的重要因子；而A n g-2是啟動(dòng)血管再次塑型的關(guān)鍵因子，主要表達(dá)于重塑或修復(fù)時(shí)的血管，A n g-1在糖尿病中后期表達(dá)下調(diào)，通過外源性A n g-1干預(yù)形成更加成熟穩(wěn)定的血管。A n g-2升高表明糖尿病腎病中后期有血管不完整及不穩(wěn)定性，表明它是啟動(dòng)血管再次重構(gòu)的主要因子；糖尿病腎病后期有血管破壞，重塑新生的血管。提示A n g-1對糖尿病腎臟血管新生產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。另外，研究顯示，在腹膜的新生血管形成期間，A n g-1出現(xiàn)下調(diào)，這是誘發(fā)新生血管后續(xù)消失的重要因素；通過給予A n g-1（外源性），有助于減輕糖尿病并發(fā)癥，諸如能夠有效緩解患者血-視網(wǎng)膜屏障紊亂，延緩腎臟纖維化進(jìn)展［13-14］。

目前采用A n g-1干預(yù)性治療慢性腎臟病尤其是糖尿病腎病的研究報(bào)道較少，且多為短期實(shí)驗(yàn)觀察。本實(shí)驗(yàn)旨在探討促進(jìn)血管新生和穩(wěn)定對DN進(jìn)展的影響，實(shí)驗(yàn)中如重組腺病毒A n g-1給予時(shí)間、劑量、途徑僅參照國外文獻(xiàn)，評價(jià)血管新生的指標(biāo)，還有待進(jìn)一步繼續(xù)研究。

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（申海菊 編輯）

Effect of recombinant adenovirus angiopoietin-1 on renal angiogenesis in diabetic rats*

Zi-yang Zhang，Zhou-ke Tan，Ming-yan Cao，Yi-bin Yang
（Department of Nephropathy and Rheumatology，the First Affiliated Hospital of Zunyi Medical School，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To establish diabetic nephropathy rat model and observe diabetic kidney exogenous expression of angiopoietin-1（Ang-1）by adenovirus and to study its effect on generation of new blood vessels inthe kidneys，inorder toprovidereference for clinical treatment of diabeticnephropathy.M ethods Streptozotocin（STZ）was chosen for diabetic nephropathy modeling of SD rats.The model rats were divided into two groups，namely normal control group and diabetic nephropathy group；and diabetic nephropathy model group was further divided into three subgroups as diabetic group，empty vector group and Ang-1 adenovirus group.Since the eighth week of successful rat modeling，Ang-1 adenovirus vector and empty vector were injected through tail vein.At different time，such as the 8th week，12th week，20th week and 28th week，the level of urine protein content of each group was detected，and kidney level of Ang-2 mRNA was analyzed using real-time quantitative PCR.Results Urinary proteins of the diabetic nephropathy model group were significantly higher than those in the healthy rats（P＜0.01），and only in the first 20 weeks，urine protein levels of the empty vector group and the diabetic group were significantly lower than those in the Ang-1treatment group（P＜0.01）.Urine protein content and Ang-2 mRNA were not detected in healthy kidney tissue of the control group；while those in the diabetes group，empty vector group and Ang-1 adenovirus group were significantly elevated after the 12th week，especially those of the Ang-1 adenovirus group with the peak values at the 20th week（P＜0.05）；and reduced in the 28th week，Ang-2 mRNA levels of the diabetic group，empty vector group and Ang-1adenovirus group were statistically different（P＜0.05）.Ang-2 and urinary protein excretion showed a negative correlation（r=-0.601，P＜0.05）.Conclusions The exogenous administration of Ang-1 in diabetic kidney has a protective effect on angiogenesis.

angiopoietin；diabetic nephropathy；angiogenesis；adenoviral vector

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.001

1005-8982（2016）15-0001-05

2015-12-07

國家自然科學(xué)基金（No：81260118）

楊亦彬，E-mail：yyb1011@sina.com；Tel：13765930909