祝筱姬，朱雙雙，韓瑋，貝媛媛，鐘玉緒，劉菲，王濤，趙超，趙建

（1.解放軍第89醫(yī)院 呼吸科，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生處，山東 濰坊 261042；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850；4.解放軍第89醫(yī)院 病理科，山東 濰坊 261021；5.解放軍第89醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濰坊 261021）

論著

芥子氣經(jīng)腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷細(xì)胞凋亡的變化*

祝筱姬1，朱雙雙2，韓瑋1，貝媛媛2，鐘玉緒3，劉菲1，王濤4，趙超5，趙建3

（1.解放軍第89醫(yī)院 呼吸科，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生處，山東 濰坊 261042；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850；4.解放軍第89醫(yī)院 病理科，山東 濰坊 261021；5.解放軍第89醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濰坊 261021）

目的經(jīng)腹腔和氣管建立大鼠芥子氣（S M）急性肺損傷動物模型，比較兩種大鼠急性肺損傷模型細(xì)胞凋亡的差異。方法選取S p r a g u e D aw l ey大鼠136只，隨機(jī)分為5組，正常對照組8只，其他4個(gè)組為腹腔S M組、腹腔丙二醇對照組、氣管S M組、氣管丙二醇對照組，每組32只。腹腔S M組腹腔內(nèi)注入稀釋的S M 0.1m l（0.96 L D50=8m g/k g），氣管S M組氣管內(nèi)注入稀釋的S M 0.1m l（0.98 L D50=2m g/k g），正常對照組未做任何處理。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d U T P缺口末端標(biāo)記測定法（T U N EL）染色和免疫組織化學(xué)法及電鏡觀察，判斷細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果①腹腔S M組各時(shí)間段肺泡間隔T U N EL染色陽性細(xì)胞表達(dá)率較氣管S M組增多（P＜0.05）。②腹腔S M組各時(shí)間段肺泡間隔凋亡蛋白Ba x陽性表達(dá)率較氣管S M組升高（P＜0.05）；腹腔S M組各時(shí)間段肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2陽性表達(dá)率較氣管S M組降低（P＜0.05）。③腹腔S M組各時(shí)間段肺泡間隔凋亡蛋白酶C a s pa s e-3、C a s pa s e-9陽性表達(dá)率較氣管S M組增多（P＜0.05）。④電鏡顯示，染毒72 h，腹腔S M組和氣管S M組Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮凋亡細(xì)胞形態(tài)特征為上皮細(xì)胞膜附著的微絨毛斷裂缺失，排列紊亂；線粒體嵴模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著的核糖體脫離，并游離于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論S M經(jīng)腹腔和氣管染毒致大鼠急性肺損傷，通過內(nèi)源性通道引發(fā)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常，S M經(jīng)腹腔染毒大鼠各項(xiàng)細(xì)胞凋亡指標(biāo)比經(jīng)氣管明顯升高，推測可能與S M腹膜腔的快速吸收有關(guān)。

芥子氣；肺損傷；細(xì)胞凋亡

芥子氣（s u l fu r m u stard，S M）是一種最常用的化學(xué)武器，據(jù)統(tǒng)計(jì)其致傷率占所有化學(xué)武器的80%［1］。S M的主要靶器官是皮膚、肺、眼睛，其死亡率主要來自肺損傷和呼吸道病變［2］。S M中毒的病理生理機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及DN A和蛋白質(zhì)烷化、酶功能失調(diào)、基因表達(dá)改變、氧自由基產(chǎn)生過剩和能量耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻，細(xì)胞凋亡或死亡，且所有階段均伴隨炎癥反應(yīng)［3］。S M誘導(dǎo)肺損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，且細(xì)胞凋亡是S M誘導(dǎo)肺損傷的重要機(jī)制之一［4］。動物實(shí)驗(yàn)表明，S M經(jīng)口服、皮膚、皮下、靜脈、腹腔、氣管途徑均可致急性肺損傷，并且具有時(shí)間和劑量依賴性［1］。本實(shí)驗(yàn)通過建立高劑量S M經(jīng)腹腔和氣管途徑致大鼠急性肺損傷模型，探討其細(xì)胞凋亡的細(xì)胞和分子機(jī)制，為將來的干預(yù)性治療奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1，2-丙二醇溶液由天津致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司提供，羊血清由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，微波緩沖液自配，試劑由北京化工廠提供，R oche細(xì)胞凋亡試劑由瑞士羅氏生物科技公司提供，B a x、B cl-2、活化的胱天蛋白酶（C aspase）-3、C aspase-9試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，H-7500型透射電鏡由日本日立公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康雄性S pra g u e Da w ley大鼠（S P F級，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：0015902）136只，體質(zhì)量280～300 g，年齡15周。

將大鼠分為腹腔S M組（32只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管S M組（32只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對照組（8只）。S M液（純度＞90%）臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。①氣管途徑染毒動物模型建立：實(shí)驗(yàn)前氣管S M組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05m g/k g），30min后腹腔內(nèi)注射鹽酸氯胺酮（100m g/k g）實(shí)施麻醉，氣管內(nèi)注入稀釋的S M 0.1ml （0.98L D50=2m g/k g），氣管丙二醇組注入丙二醇0.1ml。②腹腔途徑染毒動物模型建立：同上方法實(shí)施麻醉。腹腔S M組大鼠腹腔內(nèi)注入稀釋的S M 0.1ml（0.96 L D50=8m g/k g），腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1ml。正常對照組未做任何處理。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1制備石蠟切片與電鏡觀察收集大鼠肺組織標(biāo)本共136份，10%中性福爾馬林溶液固定標(biāo)本24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法（hemato x ylin-eosin stainin g，H E）染色，光鏡觀察。制備超薄切片：取新鮮標(biāo)本1mm3，用3%戊二醛液固定標(biāo)本，別在70%、80%、90%和100%丙酮梯度脫水15min，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。

1.3.2末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d U T P缺口末端標(biāo)記測定（t e r m in a l-d e o x y n u c l e o i t i d y l tr a ns f e r a s e m e d i a t e d ni c k e n d l a b e l ing，T U N EL）法標(biāo)記凋亡細(xì)胞4μm石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，0.3%雙氧水H202處理10min；1∶200的P roteinase K稀釋液消化10min；標(biāo)記緩沖液末端轉(zhuǎn)移酶（terminal deo x yn u cleotidyl trans f erase，TdT）和異羥基洋地黃毒苷配基標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（di g o x i g enin-deo x y u ridine triphosphate，D IG-d U T P）各1μl，加入18μl標(biāo)記緩沖液，每片20μl，37℃標(biāo)記2 h。封閉液每片50μl，室溫處理30min?？贵w稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50μl，37℃孵育30min?？贵w稀釋液l∶100稀釋鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，每片50μl，37℃孵育30min。新鮮配制二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色20min，蘇木素復(fù)染，0.01mol三羥基甲胺-鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-H C l b uff er saline，T B S）終止反應(yīng)，甘油明膠封片。以不加TDT酶作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照組。

1.3.3凋亡蛋白Ba x和B c l-2檢測免疫組織化學(xué)法檢測凋亡蛋白B a x和B cl-2的表達(dá)。石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，滴加兔抗大鼠B a x和B cl-2單克隆抗體20μl/片，再滴加二抗，三乙烯二胺（triethylene diamine，D A B C）顯色，蘇木精襯染，常規(guī)樹脂封片。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate b uff er saline，P B S）代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照組。

1.3.4C a s pa s e-3和C a s pa s e-9檢測免疫組織化學(xué)法檢測C aspase-3和C aspase-9的表達(dá)。石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，滴加兔抗大鼠C aspase-3和C aspase-9單克隆抗體20μl/片，再滴加二抗，D A B C顯色，蘇木精襯染，常規(guī)樹脂封片。P B S代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照組。

1.3.5顯微圖像分析采用I ma g e-P ro P l u s 6.0病理細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，將各組T U NE L標(biāo)記及B a x、B cl-2、C aspase-3、C aspase-9免疫組織化學(xué)法染色切片行圖像分析，選取測量參數(shù)，測定陽性率和強(qiáng)陽性率，每間隔1個(gè)高倍視野（400倍）選取1個(gè)視野進(jìn)行觀察，每張切片觀察≥5個(gè)高倍視野，計(jì)算其肺泡間隔陽性細(xì)胞比率，肺泡間隔陽性細(xì)胞比率=5個(gè)高倍視野的陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，并計(jì)算其平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用S P SS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±平均差（x±s）表示，多組間比較用重復(fù)測量的多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠肺泡間隔細(xì)胞凋亡情況

2.1.1T U N EL染色腹腔S M組6和24 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞呈帶狀分布，48 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞聚集成簇，72 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞呈團(tuán)簇狀；氣管S M 組6、24、48和72 h肺泡間隔細(xì)胞凋亡聚集成簇；丙二醇和正常對照組凋亡細(xì)胞呈零星分布（見圖1）。5組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果：①腹腔和氣管S M組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.479，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1 318.654，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.623，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖2、3）。

2.1.2Ba x免疫組織化學(xué)法腹腔和氣管S M組6 h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達(dá)呈帶狀分布，24 h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達(dá)聚集成簇，48和72h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達(dá)呈團(tuán)簇狀；丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達(dá)呈零星分布（見圖4）。5組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果：①腹腔和氣管S M組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.202，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=490.828，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.031，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖5、6）。

圖1　大鼠肺泡間隔TUN E L染色 （×400）

圖2　5組大鼠肺泡間隔TUN E L染色細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢

圖3　大鼠肺泡間隔TUN E L染色陽性細(xì)胞表達(dá)率

2.1.3B c l-2免疫組織化學(xué)法腹腔和氣管S M組6 h肺泡間隔凋亡蛋白B cl-2陽性表達(dá)呈團(tuán)簇狀，24 h肺泡間隔凋亡蛋白B cl-2陽性表達(dá)聚集成簇，48和72 h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達(dá)呈帶狀分布。丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡蛋白B cl-2陽性表達(dá)呈零星分布（見圖7）。5組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果：①腹腔和氣管S M組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=211.833，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=617.955，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=134.574，P=0.000），呈遞減趨勢（見圖8、9）。

圖4　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白Ba x表達(dá) （×400）

圖5　5組大鼠肺泡間隔凋亡蛋白Ba x陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢

圖6　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白Ba x陽性表達(dá)率

2.1.4C a s pa s e-3免疫組織化學(xué)法腹腔和氣管S M 組6 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-3陽性表達(dá)呈帶狀分布，24 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-3陽性表達(dá)聚集成簇，48和72 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-3陽性表達(dá)呈團(tuán)簇狀。丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-3陽性表達(dá)呈零星分布（見圖10）。5組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果：①腹腔和氣管S M組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.201，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=759.817，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.073，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖11、12）。

圖7　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2表達(dá) （×400）

圖8　5組大鼠肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢

圖9　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2陽性表達(dá)率

圖10　大鼠肺泡間隔Caspase-3表達(dá) （×400）

圖11　5組大鼠肺泡間隔凋亡細(xì)胞Caspase-3陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢

圖12　大鼠肺泡間隔凋亡細(xì)胞Caspase-3陽性表達(dá)率

2.1.5C a s pa s e-9免疫組織化學(xué)法腹腔和氣管S M組6 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-9陽性表達(dá)呈帶狀分布，24 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-9陽性表達(dá)聚集成簇，48和72 h肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-9陽性表達(dá)呈團(tuán)簇狀。丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡細(xì)胞C aspase-9陽性表達(dá)呈零星分布（見圖13）。5組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果：①腹腔和氣管S M組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.755，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 087.109，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.844，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖14、15）。

2.2大鼠肺泡上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化

染毒72 h，腹腔和氣管S M組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮凋亡細(xì)胞形態(tài)特征：上皮細(xì)胞膜附著的微絨毛斷裂缺失，排列紊亂；線粒體嵴模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著的核糖體脫離，并游離于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核染色質(zhì)正常。丙二醇和正常對照組肺泡上皮形態(tài)：細(xì)胞膜、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核染色質(zhì)正常。見圖16。

圖13　大鼠肺泡間隔Caspase-9表達(dá) （×400）

圖14　5組大鼠肺泡間隔凋亡細(xì)胞Caspase-9陽性表達(dá)率不同時(shí)間的變化趨勢

圖15　大鼠肺泡間隔凋亡細(xì)胞Caspase-9陽性表達(dá)率

圖16　大鼠肺泡上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

3　討論

細(xì)胞凋亡包括內(nèi)源性（線粒體）和外源性（死亡受體）兩種通路［5］。內(nèi)源性通路啟動經(jīng)促凋亡分子（細(xì)胞色素C）從線粒體釋放到胞漿內(nèi)，導(dǎo)致C aspase-9激活，最后激活C aspase-3；外源性通路經(jīng)細(xì)胞表面死亡受體誘導(dǎo)，刺激死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（adaptor F as-associated protein w ith death domain，F(xiàn) P DD）和死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)腫瘤壞死因子受體（t u mor necrosis f actor receptor 1A-associatedv iadeathdomain，T R A DD），依次激活啟動因子胱天蛋白酶原-8、-10。F P DD/T R A DD和 P rocaspaese-8，P rocaspaese-10組合成誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合體（death-ind u cin g si g nalin g comple x，D I S C），D I S C能促進(jìn)自身程序，啟動P rocaspase活化，激活胱天蛋白酶原-8、-10并從蛋白復(fù)合體中游離。C aspaese-8、C aspaese-10可直接激活下游C aspaese-3、C aspaese-7導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6-7］。C aspaese是一種關(guān)鍵的蛋白酶，在兩種細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮重要作用［8］。內(nèi)源性通路和外源性通路均需激活C aspaese-3，其是細(xì)胞凋亡中的效應(yīng)因子［9］。在許多生物過程中，細(xì)胞的生存與死亡取決于線粒體表面的B cl-2家族成員。B cl-2家族蛋白由促凋亡（B a x、B a k、B o k）和抗凋亡（B cl-2、B cl-x l）蛋白組成，主要在線粒體水平調(diào)控C aspase活性［10-11］。B cl-2和B cl-x l可穩(wěn)定線粒體的完整性，B a x和B a k則可使小細(xì)胞器喪失穩(wěn)定性。當(dāng)B a x激活時(shí)，可嵌入線粒體外膜內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞色素C釋放和細(xì)胞凋亡。反之，B cl-2表達(dá)過剩可抑制B a x激活，阻止DN A損傷和細(xì)胞色素C釋放［12］。細(xì)胞凋亡還包括細(xì)胞核形態(tài)改變、凋亡小體形成、胞質(zhì)凝聚、線粒體膜電位降低、細(xì)胞內(nèi)酸化、絲氨酸磷脂?；懵队诩?xì)胞表面、細(xì)胞皺縮、膜出泡［3］。S M可觸發(fā)多種分子通路致肺損傷，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、補(bǔ)給失調(diào)、蛋白水解酶與抗蛋白水解酶失調(diào)、炎癥、氣道重塑、基因失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞的完整性和功能喪失［13-17］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，S M主要通過線粒體通路和死亡受體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2，4，8，18］。S M誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)相當(dāng)復(fù)雜，還涉及3種絲裂原活化蛋白激酶（mito g en-acti v ated protein k inase，M A P K）通路和核因子-κB（n u clear f actor κB，N F-κB）通路、P53和胱天蛋白酶-多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly A D P-ribose polymerase，P A R P，C aspase-P A R P）通路、鈣調(diào)蛋白通路［19-22］。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，S M誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡常與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、DN A損傷伴隨，并與其伴隨的反應(yīng)程度呈正相關(guān)［23-26］。由此可見，在S M誘導(dǎo)肺損傷中，細(xì)胞凋亡是重要的分子和細(xì)胞損傷機(jī)制之一。

本研究通過T U NE L染色檢測發(fā)現(xiàn)，腹腔和氣管S M組肺泡間隔凋亡細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長呈遞增趨勢。腹腔S M組各時(shí)間段肺泡間隔凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)率較氣管S M組明顯增多（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)法顯示，腹腔和氣管S M組肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達(dá)隨時(shí)間延長呈遞增趨勢，而凋亡蛋白B cl-2則呈遞減趨勢。腹腔和氣管S M組肺泡間隔凋亡蛋白酶C aspase-3、C aspase-9陽性表達(dá)隨時(shí)間延長呈遞增趨勢。電鏡顯示，染毒72h，腹腔S M組和氣管S M組Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮凋亡細(xì)胞形態(tài)特征為上皮細(xì)胞膜附著的微絨毛斷裂缺失，排列紊亂；線粒體嵴模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著的核糖體脫離，并游離于細(xì)胞質(zhì)中。本研究結(jié)果提示，經(jīng)兩種途徑致大鼠急性肺損傷中細(xì)胞凋亡是S M損傷機(jī)制之一，像炎癥反應(yīng)一樣，與S M的暴露劑量和時(shí)間呈正相關(guān)［27］。同時(shí)證實(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是經(jīng)線粒體通路。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S M誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可通過線粒體通路和死亡受體通路，且兩種通路之間存在著相互關(guān)聯(lián)性［28-29］。筆者檢測的凋亡蛋白指標(biāo)顯示，促凋亡蛋白B a x表達(dá)增多，抗凋亡蛋白B cl-2表達(dá)減少，B a x/B cl-2比值增加，該比值的變化與T U NE L染色凋亡細(xì)胞逐漸增加趨勢相符合。檢測的凋亡蛋白酶指標(biāo)提示，啟動因子C aspase-9和效應(yīng)因子C aspase-3均呈陽性表達(dá)，表明線粒體通路中C aspase裂解和觸發(fā)作用被激活［30-31］。該凋亡蛋白酶的變化與R A Y［8］和S OU R DE V A L等［32］報(bào)道結(jié)果相同。電鏡顯示，S M誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化主要在細(xì)胞膜、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。學(xué)者推測該損傷現(xiàn)象可能與線粒體膜通透性改變和線粒體膜電位降低及鈣離子失衡有關(guān)［33-34］。由此表明，線粒體是細(xì)胞易損傷的微小器官和生物程序的主要調(diào)控點(diǎn)［11］。一旦線粒體損傷，則會激活多種促凋亡分子信號通路，有助于加速細(xì)胞的自我毀滅［35-36］。筆者認(rèn)為，S M誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是多種因素作用的結(jié)果，其分子和細(xì)胞機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，這種網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)通路尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，S M經(jīng)腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷通過內(nèi)源性通道引發(fā)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常，S M經(jīng)腹腔染毒大鼠各項(xiàng)細(xì)胞凋亡指標(biāo)比氣管明顯升高，推測可能與S M腹膜腔的快速吸收有關(guān)。在經(jīng)腹腔和氣管造模劑量的選擇方面，研究發(fā)現(xiàn)，S M腹腔注射引起的肺損傷較經(jīng)皮下注射或口服途徑染毒更嚴(yán)重［37］。當(dāng)大鼠經(jīng)腹腔注射S M劑量＞10m g/k g時(shí)，就會出現(xiàn)大鼠死亡［38］。顯然筆者選擇經(jīng)腹腔和氣管S M L D50相近的劑量建立急性肺損傷模型，S M肺損傷細(xì)胞凋亡的反應(yīng)程度出現(xiàn)差異性，說明血液對S M的吸收可能占主導(dǎo)作用。本研究提示，在S M L D50相同劑量下，并非是經(jīng)氣管致肺損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最重，為S M肺損傷的靶向干預(yù)提供有價(jià)值的參數(shù)。

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（童穎丹 編輯）

Changes of apoptosis in acute pulmonary injury of rats induced by intraperitoneal and tracheal injection of sulfur mustard*

X iao-j i Z h u1，S h u an g-sh u an g Z h u2，W ei H an1，Y u an-y u an B ei2，Y u-x u Z hon g3，F(xiàn) ei L i u1，Tao W an g4，C hao Z hao5，J ian Z hao3
（1.Department of Respiratory Diseases，the 89th Hospital of PLA，Weifang，Shandong 261021，China；2.Graduate Department，Weifang Medical College，Weifang，Shandong 261042，China；3.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；4.Department of Pathology；5.Clinical Laboratory，the 89th Hospital of PLA，Weifang，Shandong 261021，China）

Objective To establish rat models of sulfur mustard（SM）-induced acute lung injury via intra-peritoneal and tracheal injection，and compare the difference in apoptosis of the two models.M ethods A total of 136 male Sprague Dawley rats were selected and randomly divided into control group with 8 cases and other four groups（i.e.intraperitoneal SM group，intraperitoneal glycol propylene group，tracheal SM group and tracheal glycol propylene group with 32 cases in each group）.The intraperitoneal SM group was intraperitoneally injected with 0.1m l diluted SM（0.96 LD50=8mg/kg），the tracheal SM group had intratracheal injection of 0.1m l diluted SM（0.98 LD50=2mg/kg），meanwhile the status quo was kept with the control group. SM-induced apoptosis was observed by TUNEL staining and immunohistochemical staining as well as electron microscopy.Results In the alveolar septum，the expression rate of positive cells by TUNEL staining in the intraperitoneal SM group was increased compared with that in the tracheal SM group at the same period of time（P＜0.05）.In the alveolar septum，a significantly higher positive expression rate of Bax protein was detected by immunohistochemical staining in the intraperitoneal SM group at different periods of time compared with that in the tracheal SM group at the corresponding period（P＜0.05）；while a significantly lower positive expression rate of Bcl-2 protein was detected by immunohistochemical staining in the intraperitoneal SM group at different periods of time compared with that in the tracheal SM group at the corresponding period（P＜0.05）.In the alveolar septum，the expression rates of caspase-3 and caspase-9 by immunohistochemical staining in the intraperitoneal SM group at different periods of time were increased compared those with the tracheal SM group at the corresponding period（P＜0.05）.Electron microscopic observation confirmed that both type I and type II alveolar epithelial cells in the lungs exhibited apoptotic morphologic features，such as break，loss and disarrangement of the microvilli on cell membrane，blurred mitochondrial cristae，and detachment and dissociation of the ribosomes from the surface of the rough endoplasmic reticula.Conclusions Our results showed that dysregulation of apoptosis via intrinsic pathways in the intraperitoneal SM group and the tracheal SM group leads to up-regulation of apoptosis.In SM-induced acute lung injury in rats via intraperitoneal route，the index of apoptosis is significantly higher than that via tracheal route，which may be related to fast absorption of SM in the peritoneal cavity.

sulfur mustard；lung injury；apoptosis

R 114；R 563.8文獻(xiàn)識別碼：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.003

1005-8982（2016）15-0011-11

2015-01-19

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)（No：2013Z X09J13103-01B）

趙建，E-mail：j ian_z hao@126.com；Tel：010-66931646，18910216751