陳國福，吳麗君，張雪鵬，蔡準，孟祥潮

（華北理工大學附屬醫(yī)院 腫瘤外科，河北 唐山 063000）

論著

缺氧條件下沉默解聚素-金屬蛋白酶17基因對人乳腺癌MC F-7細胞增殖的影響*

陳國福，吳麗君，張雪鵬，蔡準，孟祥潮

（華北理工大學附屬醫(yī)院 腫瘤外科，河北 唐山 063000）

目的探討在缺氧條件下靶向針對解聚素-金屬蛋白酶17（ADA M 17）基因的短發(fā)夾R NA（s h R NA）對人乳腺癌MC F-7細胞增殖的作用機制。方法針對ADA M 17基因設計具有特異性ADA M 17-s h R NA，經(jīng)電穿孔轉染MC F-7細胞。依據(jù)細胞培養(yǎng)條件（常氧和缺氧）和細胞轉染因素（空白P B S、轉染無義序列ADA M 17-s h N C、轉染ADA M 17-s h R NA），實驗分為常氧對照組、常氧s h N C組、常氧s h R NA組、缺氧對照組、缺氧s h N C組和缺氧s h R NA組。通過充入1%氧O2、5%二氧化碳C O2和94%氮N 2的混合氣體培養(yǎng)箱模擬缺氧環(huán)境，分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（q R T-P C R）、i C ELL ig e n c e系統(tǒng)、流式細胞儀檢測MC F-7細胞的ADA M 1基因的表達水平、細胞生長曲線、增殖活性和細胞周期。結果靶向針對ADA M 17基因的ADA M 17-s h R NA在缺氧條件下可以有效沉默人乳腺癌MC F-7細胞ADA M 17基因的表達（缺氧s h R NA組2-△△CT=0.55±0.16）。從而導致MC F-7細胞生長速度減慢，細胞增殖能力降低，細胞周期延緩。結論ADA M 17 s h R NA和缺氧存在協(xié)同作用，共同抑制腫瘤細胞的增殖。

解聚素-金屬蛋白酶17；乳腺癌；缺氧；增殖；細胞周期

缺氧是惡性實體腫瘤的重要生物學特征之一，缺氧與腫瘤的增殖、侵襲、轉移密切相關［1］。缺氧的腫瘤細胞易發(fā)生基因突變，對放化療更加耐受［2］。相關研究已證實，缺氧是乳腺癌等實體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一［3］。解聚素-金屬蛋白酶17（a disinteg rin and metalloproteinases 17，A D A M17）是解聚素-金屬蛋白酶家族的重要成員之一，目前，研究發(fā)現(xiàn)A D A M17在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到極其重要的作用。R N A干擾（R N A inter f erence，R N A i）是一種強大的基因沉默技術。課題前期研究發(fā)現(xiàn)，利用R N A i技術轉染A D A M17 si R N A到乳腺癌MC F-7細胞中，可沉默MC F-7細胞A D A M17基因的表達，抑制其細胞的侵襲、趨向運動能力及增殖能力［4-5］。但關于在缺氧條件下利用R N A i沉默A D A M17基因對人乳腺癌MC F-7細胞增殖的影響研究甚少，本研究旨在揭示缺氧和A D A M17與腫瘤細胞增殖的關系。初步探討R N A i和缺氧微環(huán)境對腫瘤細胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料

MC F-7細胞系購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞庫，Tri z ol、M-M L V逆轉錄試劑盒、PI atim u m S YB R PC R試劑盒均由美國I n v itro g en公司提供，A D A M17 sh R N A和A D A M17 shN C載體購買于上海吉瑪制藥技術有限公司，每個載體均包含綠色熒光蛋白G F P的表達框架，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達情況來確定轉染效率。靶序列如下：A D A M17靶序列p GP U6/G F P/Neo-homo-A D A M17為5'-GG AA C T C TT GG A TT A GC TT A T-3'，陰性對照無義序列p GP U6/ G F P/Neo-shN C：5'-G TT C T CCG AA CG T GC A CG T-3'。

1.2方法

1.2.1實驗分組依據(jù)細胞培養(yǎng)條件和細胞轉染因素的不同，實驗分為6組，見表1。

1.2.2細胞培養(yǎng)將人乳腺癌MC F-7細胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素混合液的D M E M高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。常氧：即常氧下培養(yǎng)，37℃恒溫、95%空氣、5%二氧化碳C O2、飽和濕度條件下于C O2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；缺氧：即缺氧下培養(yǎng)，37℃恒溫，注入含1%氧O2、5%C O2、94%氮N2混合氣體的賽默Thermo3131水套式培養(yǎng)箱內(nèi)，飽和濕度下缺氧培養(yǎng)。

表1　實驗分組

1.2.3電穿孔法轉染收集細胞，每個電擊杯中添加1×106個細胞，每個電擊杯中添加5μl的A D A M17-sh R N A，加入質(zhì)粒。充分混勻細胞，上機操作。設置C UY21 ED I TⅡ細胞電轉化儀的輸出電壓（125 V）、脈沖寬度（10ms）和電轉時間（1min），電處理結束后，加入完全培養(yǎng)液。同樣的方法轉染shN C組和對照組，shN C組加入轉染試劑和無義序列A D A M17-shN C，對照組加入與轉染試劑和A D A M17-sh R N A混合總量等量的 P B S。

1.2.4q R T-P C R檢測MC F-7細胞的ADA M 17 mR NA的表達水平成功轉染12～24 h后，根據(jù)細胞培養(yǎng)條件的不同，分別置入常氧下培養(yǎng)和缺氧下培養(yǎng)24～48 h，按Tri z ol試劑說明書一步法提取總R N A，測定總R N A的純度和濃度符合實驗要求后采用M-M L V試劑盒合成cDN A，P iatim u m S YB R試劑盒進行PC R擴增反應。A D A M17引物序列：上游5'-A T C AAA CCC TTT CC T GCG-3'，下游5'-C AAA CCC A T CC T CG T CC A-3'，擴增片段長度154 bp；β-actin內(nèi)參引物序列：上游5'-G T C A CC TT C A CCG TT CC A G T TTT-3'，下游5'-TT C TTT CCC A C A TT GCG TT G A TT C-3'，擴增片段長度175 bp。對實驗結果采用相對定量的方法進行分析。

1.2.5i C ELL ig e n c e系統(tǒng)檢測MC F-7細胞的增殖使用i C E LL i g ence系統(tǒng)進行檢測，在E-P late L8孔中加入300μl混合均勻的細胞懸液。將1塊 E-P late L8放到水套式培養(yǎng)箱中的i C E LL i g ence上行缺氧培養(yǎng)。另1塊放到C O2培養(yǎng)箱中的i C E LL i g ence上行常氧培養(yǎng)。用i C E LL i g ence系統(tǒng)檢測，導出實驗數(shù)據(jù)和結果圖，傳感器檢測獲得的細胞阻抗參數(shù)用細胞指數(shù)（CI）來表示，應用i C elli g ence D A S o f t w are 1.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖像處理。

1.2.6流式細胞儀分析細胞周期成功轉染12～24 h后，根據(jù)細胞培養(yǎng)條件的不同，分別置入常氧和缺氧下培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，加入預冷的70%乙醇2ml充分懸浮細胞，置于4℃固定細胞24 h以上。細胞固定好后，加入預冷的P B S液重懸細胞，加入濃度為50μg/ml的PI染液500μl，室溫避光染色30min。用300鉬濾網(wǎng)過濾細胞懸液，選用標準程序經(jīng)流式細胞儀檢測。經(jīng)細胞周期軟件M od F it分析結果。

1.3統(tǒng)計學方法

采用S P SS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析，進行兩個實驗因素的各水平全面組合的實驗時，用兩因素析因設計的方差分析各實驗因素的單獨效應、主效應和因素的交互效應，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1MC F-7細胞成功轉染s h RN A表達載體

轉染后連續(xù)常氧下培養(yǎng)48 h后置于熒光倒置相差顯微鏡下觀察轉染效率，本實驗中電穿孔轉染法的效率高達90%以上（見圖1），證實本實驗應用的轉染方法是成功的。

2.2A D A M 17 m RN A相對表達水平

各組A D A M17 m R N A的相對表達量見表2。根據(jù)析因方差分析得出，細胞培養(yǎng)條件對MC F-7細胞A D A M17 m R N A的表達情況有影響；細胞轉染因素對MC F-7細胞A D A M17 m R N A的表達情況亦有影響。不同細胞培養(yǎng)條件間差異有統(tǒng)計學意義（F= 17.914，P=0.000）。缺氧條件下培養(yǎng)的MC F-7細胞的A D A M17 m R N A相對表達量低于常氧條件下培養(yǎng)的。不同細胞轉染因素之間差異有統(tǒng)計學意義（F= 50.005，P=0.000）。結合多重比較結果分析，無論常氧還是缺氧，轉染sh R N A的MC F-7細胞的A D A M17 m R N A的相對表達量低于對照組和shN C組（P＜0.05），對照組和shN C組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3細胞生長曲線和細胞增殖活性

表2　各組細胞的A D A M 17 m RN A的表達情況

圖1　熒光倒置相差顯微鏡下觀察轉染效率 （×100）

經(jīng)i C elli g ence D A S o f t w are 1.0軟件處理分析后得到細胞生長曲線（見圖2A和圖2B），并測得常氧對照組、常氧shN C組、常氧sh R N A組、缺氧對照組、缺氧shN C組和缺氧sh R N A組的CI分別為6.22、6.19、3.12、2.86、2.73和1.27。對各組MC F-7細胞進行析因方差分析得出，細胞培養(yǎng)條件對MC F-7細胞的生長速度和增殖活性有影響；細胞轉染因素對MC F-7細胞生長速度和增殖活性亦有影響。不同細胞培養(yǎng)條件比較差異有統(tǒng)計學意義（F=5.258，P= 0.000），缺氧培養(yǎng)較常氧培養(yǎng)，各組的MC F-7細胞的生長速度在24 h內(nèi)加快，24 h后減慢，增殖活性降低；不同細胞轉染因素差異有統(tǒng)計學意義（F=11.053，P=0.000），結合多重比較結果，無論常氧還是缺氧，轉染sh R N A的MC F-7細胞的生長速度和增殖活性相對于對照組和shN C組降低（P＜0.05），對照組和shN C組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4細胞周期的變化

各組的G0/G1、S、G2/M細胞周期見圖3和表3。各組的G0/G1、S、G2/M細胞周期的析因方差分析結果表明，細胞培養(yǎng)條件對MC F-7細胞周期中G0/G1、S、G2/M的情況均有影響；細胞轉染因素對MC F-7細胞周期中的G0/G1、S、G2/M亦有影響。不同細胞培養(yǎng)條件比較差異有統(tǒng)計學意義（G0/G1期：F=60.211，P=0.000；S期：F=37.061，P=0.000；G2/M期：F=10.103，P=0.014），缺氧條件下培養(yǎng)的MC F-7細胞的G0/G1期細胞多于常氧條件下培養(yǎng)的，其S、G2/期細胞均少于常氧下培養(yǎng)的；不同細胞轉染因素比較差異有統(tǒng)計學意義（G0/G1期：F=95.853，P=0.000；S期：F=31.974，P= 0.000；G2/M期：F=15.089，P=0.001）。結合多重比較結果發(fā)現(xiàn)，無論常氧還是缺氧，轉染A D A M17-sh R N A 的MC F-7細胞的G0/G1期細胞多于對照組和shN C組（P＜0.05），S期和G2/M期細胞少于對照組和shN C組（P＜0.05），而對照組和shN C組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2　各組細胞的生長曲線

圖3　各組的流式細胞周期圖

表3　各組的G0/G1、S、G2/M期細胞的百分比比較 （）

表3　各組的G0/G1、S、G2/M期細胞的百分比比較 （）

注：?與常氧對照組比較，P＜0.05

組別G2/ M常氧對照組　5 4 . 3 8 ± 1 . 9 5 　3 3 . 8 0 ± 4 . 0 9 　1 1 . 8 2 ± 2 . 7 0常氧s h N C組　5 3 . 0 3 ± 2 . 5 2 　3 6 . 0 1 ± 1 . 5 5 　1 0 . 9 7 ± 1 . 9 4常氧s h R N A組　7 0 . 1 0 ± 1 . 8 5?　2 3 . 6 0 ± 1 . 0 9?　6 . 3 0 ± 0 . 8 2?缺氧對照組　6 2 . 8 4 ± 2 . 0 9?　2 6 . 1 5 ± 1 . 5 8?　1 1 . 0 2 ± 2 . 3 8缺氧s h N C組　6 2 . 5 7 ± 1 . 1 0?　2 7 . 5 1 ± 1 . 9 8?　9 . 9 2 ± 1 . 9 5缺氧s h R N A組　7 4 . 3 5 ± 2 . 3 6?　2 0 . 9 7 ± 1 . 3 5?　5 . 3 5 ± 0 . 3 8?G0/ G1S

3　討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)文獻報道2000～2006年我國女性乳腺癌粗發(fā)病率為6.96/10萬～71.46/10萬，且呈明顯上升趨勢［6］。目前多采用手術、放化療和內(nèi)分泌治療等綜合治療手段，但效果并不理想。近年來，隨著分子生物學技術的提高和對腫瘤發(fā)病機制的深入認識，開始針對細胞受體、關鍵基因和調(diào)控分子為靶點的治療研究，即“靶向治療”［7］。基因靶向治療是當前乳腺癌治療領域研究的熱點。

A D A M17是解聚素-金屬蛋白酶家族的重要成員之一，具有解聚素和金屬蛋白酶的活性，A D A M17發(fā)揮蛋白剪切酶樣的作用，使得蛋白細胞膜外功能區(qū)脫落，激活或釋放許多結構和功能不同的分子，從而調(diào)節(jié)如增殖、運動能力等多種細胞生物學行為［8］。目前研究發(fā)現(xiàn)，A D A M17在多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，如乳腺癌［9］、腦膠質(zhì)瘤［10］、頭頸部鱗癌［11］、卵巢癌等［12］。R N A i表現(xiàn)為雙鏈R N A，以序列特異性的方式來沉默內(nèi)源性基因的表達?，F(xiàn)大多數(shù)si R N A表達載體被設計成能表達短的發(fā)夾狀R N A（sh R N A），使得sh R N A在細胞內(nèi)表達，隨后被加工成si R N A，從而發(fā)揮基因沉默作用。近來提出運用R N A i技術下調(diào)A D A M17表達水平，可以逆轉乳腺癌細胞的惡性性狀［13］，亦可抑制乳腺腫瘤的生長和侵襲能力，本實驗研究證實，A D A M17-sh R N A可以有效沉默人乳腺癌MC F-7細胞A D A M17基因的表達，從而降低細胞生長速度，延緩細胞周期，抑制細胞增殖。馬雷等［14］采用sh R N A沉默S100A4基因對乳腺癌MC F-7細胞體外增殖和遷移力具有抑制作用。R N A i抑制效果確切，為臨床乳腺腫瘤的治療提供一種有效的新方法。

相關研究已證實，缺氧是乳腺癌等實體腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一［3］。隨著腫瘤細胞的快速生長，體積增大，其內(nèi)部血液供應不足，逐漸導致腫瘤內(nèi)部氧的供應和消耗發(fā)生失衡，局部微環(huán)境的缺氧可以影響腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移、凋亡等惡性生物學行為的發(fā)生。趙婷婷等［15］發(fā)現(xiàn)，缺氧對乳腺癌細胞的生物學行為產(chǎn)生重要影響，尤其是增加乳腺癌細胞遷移、侵襲的能力。張博等［16］發(fā)現(xiàn)，缺氧能上調(diào)人乳腺癌MC F-7細胞mi R N A-21表達，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖?；谝陨险J識，本研究采用R N A i技術將針對A D A M17基因的sh R N A表達載體轉染入乳腺癌MC F-7細胞，通過體外模擬缺氧微環(huán)境，旨在觀察缺氧條件下沉默A D A M17基因對人乳腺癌MC F-7細胞增殖的影響。研究結果表明，A D A M17-sh R N A在缺氧條件下沉默MC F-7細胞的A D A M17-m R N A的表達，進而導致細胞生長速度減慢，細胞增殖能力降低，降低MC F-7細胞S期、G2/M期的比例，G0/G1期出現(xiàn)明顯阻滯，細胞周期延緩。證明細胞培養(yǎng)條件（缺氧條件）和細胞轉染因素（轉染A D A M17 sh R N A）對MC F-7細胞的A D A M17-m R N A的表達、細胞生長速度和增殖活性、細胞周期均有影響。因此得出，A D A M17-sh R N A和缺氧微環(huán)境存在協(xié)同作用，共同抑制腫瘤細胞的增殖。在缺氧條件下，A D A M17與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關系將為乳腺癌靶向治療提供一個新的研究方向。有關缺氧與R N A干擾的相互作用機制有待進一步研究，相信對缺氧及R N A i技術的深入研究，將有助于人們解開腫瘤細胞和缺氧微環(huán)境之間的關系機制，為腫瘤的基礎研究和臨床靶向治療提供新的思路和方法。

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（申海菊 編輯）

Effect of silencing ADAM 17 gene on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells under hypoxia*

Guo-fu Chen，Li-jun Wu，Xue-peng Zhang，Zhun Cai，Xiang-chao Meng
（Department of Surgical Oncology，the Affiliated Hospital，North China University of Science and Technology，Tangshan，Heibei 063000，China）

Objective To investigate the effects of short hairpin RNA（shRNA）targeting at a disintegrin and metalloproteinase 17（ADAM17）gene on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells under hypoxia. M ethods The specific ADAM17-shRNA expression vector was designed for ADAM17 gene.They were transfected into human breast carcinoma cell line MCF-7 cells by electroporation.Depending on cell culture conditions（normoxia or hypoxia）and cell transfection factors（blank control PBS，transfection with ADAM17-shNC，transfection with ADAM17-shRNA），experiment groups were divided into normoxic control group，normoxic shNC group，normoxic shRNA group，hypoxic control group，hypoxic shNC group and hypoxic shRNA group. Hypoxic environment was acquired by a three gas incubator filled with 1%O2，5%CO2and 94%N2.qRTPCR was used to study the expression levels of ADAM17.The proliferative ability and cell growth curve of MCF-7 cells were detected by iCELLigence.Cell cycle distribution of MCF-7 cells was analyzed by flow cytometry.Results The specific ADAM17-shRNA expression vector could effectively silence the expression of ADAM17 gene in human breast cancer MCF-7 cells under hypoxia［hypoxic shRNA group 2-△△CT=（0.55± 0.16）］.The proliferative ability and cell growth speed of MCF-7 cells were inhibited and the cell cycle wasdelayed by shRNA transfection and hypoxic incubation.Conclusions It suggests that the synergistic effect of ADAM17-shRNA and hypoxia inhibits the proliferation of tumor cells.

ADAM17；breast cancer；hypoxia；proliferation

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.004

1005-8982（2016）15-0022-06

2015-12-28

河北省自然科學基金（No：C2010001767）；唐山市科學技術研究與發(fā)展計劃項目（No：14130256B）

張雪鵬，E-mail：sy z x p@sina.com