張文娓，王 　一，方　芳，田　明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，哈爾濱 150040)

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正交試驗(yàn)優(yōu)化厚樸七物湯水提取工藝

張文娓，王 一，方芳，田明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，哈爾濱 150040)

為優(yōu)選厚樸七物湯水提取工藝，采用正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)水提取工藝，以出膏率、含浸出物百分量和厚樸酚與和厚樸酚，及含大黃總蒽醌量為測(cè)定指標(biāo)，考察加水量，提取次數(shù)和回流時(shí)間三個(gè)因素參數(shù)，確定最佳提取工藝條件.結(jié)果表明，厚樸七物湯最佳提取工藝為回流提取3次，第一次加水10倍量提取1.5 h，第二次加水8倍量提取1.0 h，第三次加水6倍量提取0.5 h.厚樸七物湯的水提取工藝簡(jiǎn)便易行，效率高，穩(wěn)定可行.

厚樸七物湯；提取工藝；厚樸酚；和厚樸酚；大黃總蒽醌

厚樸七物湯一方出自東漢張仲景所著的《金匱要略》，由厚樸、甘草、大黃、大棗、枳實(shí)、桂枝、生姜組成，具有行氣除滿，解表散寒的功效.厚樸七物湯原為治療外感表證未罷，里實(shí)已成.腹?jié)M，大便不通，發(fā)熱，脈浮而數(shù)者.在現(xiàn)代臨床上已廣泛用于治療急性腸炎，習(xí)慣性便秘，慢性腸胃炎，腸梗阻等[1-3].本方臨床應(yīng)用多以湯劑形式，劑型比較落后，不便于質(zhì)量控制、服用、貯藏、運(yùn)輸?shù)?本文在繼承中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，根據(jù)國(guó)家新藥研發(fā)的技術(shù)要求，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化水提取工藝[3-7]，對(duì)厚樸七物湯進(jìn)行制備工藝改革，為其成藥研究奠定基礎(chǔ).

1　儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀(Waters1515，美國(guó)Waters公司)；紫外可見(jiàn)分光光度儀(UV-1601PC，日本島津公司)；超聲波清洗機(jī)(BL6-180A，上海比朗儀器有限公司)；電子分析天平(AB204-N，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(HH.S11-2，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司).

1.2試劑

厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：110729-200310，中國(guó)藥品生物制品檢定所)、和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)：110730-201011，中國(guó)藥品生物制品檢定所)、1.8-二羥基蒽醌對(duì)照品(批號(hào)：704-200115中國(guó)藥品生物制品檢定所)甲醇(色譜純、美國(guó)迪馬公司)；甲醇、三氯甲烷均為分析純(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；氨水(天津東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠).

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

稱取處方量藥材，根據(jù)湯劑提取工藝的影響因素，以預(yù)試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇L9( 34) 正交設(shè)計(jì)表,確定考察因素、水平見(jiàn)表1.

表1水提正交試驗(yàn)因素水平表

因素水平A加水量/倍B提取時(shí)間/hC提取次數(shù)/次1238,6,410,8,612,10,81.0,0.5,0.51.5,1.0,0.52.0,1.5,1.0123

精密量取2.1項(xiàng)下儲(chǔ)備液100 mL，置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后105 ℃干燥3 h，冷卻0.5 h，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率.

2.3含浸出物量測(cè)定方法

精密稱定2.1項(xiàng)下備用的干膏細(xì)粉2.0 g，置100 mL錐形瓶中，精密加乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜止1 h，水浴回流1 h，冷卻，取下錐形瓶，密塞，再次稱重，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱重，計(jì)算浸出物百分含量.

2.4含厚樸酚、和厚樸酚量測(cè)定

2.4.1對(duì)照品溶液的制備

如果將胞元結(jié)構(gòu)等效成一個(gè)等體積均質(zhì)實(shí)心單元，則該等效單元在yoz面內(nèi)與所取胞元結(jié)構(gòu)有相同的剪切模量。該等效單元在yoz面內(nèi)所承受的剪應(yīng)力為：

精密稱取厚樸酚對(duì)照品2.12 mg、和厚樸酚對(duì)照品1.54 mg，加甲醇制成每1mL含厚樸酚84.8 μg，和厚樸酚61.6 μg溶液，作為對(duì)照品溶液，備用.

2.4.2供試品溶液的制備

取2.1項(xiàng)下備用的提取液5 mL，用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷提取液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙庵?5 mL容量瓶中，搖勻，過(guò)濾，作為供試品溶液.

2.4.3測(cè)定方法

精密吸取對(duì)照品溶液5 μL與供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，并折算出每個(gè)處方量中含厚樸酚、和厚樸酚總量.色譜柱Agilent Extend ODS反相柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶水(70∶30)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：室溫.理論板數(shù)不低于3800.記錄色譜圖，HPLC圖譜見(jiàn)圖1.

圖1　厚樸酚、和厚樸酚HPLC色譜圖

2.4.4方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.4.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量比為橫坐標(biāo)作線性回歸，得厚樸酚回歸方程y= 1 381 028x+ 18 842，R2= 0.999，線性范圍為0.205 ～1.025 μg；和厚樸酚回歸方程y= 1 601 497x+ 57 843，R2= 0.999，線性范圍為0.203～1.015 μg.

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.4.2項(xiàng)下供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定厚樸酚與和厚樸酚的峰面積的RSD值分別為1.78%，1.23%.

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：分別精密吸取供試品溶液10 μL，于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，測(cè)定厚樸酚與和厚樸酚峰面積積分值的RSD值分別為1.59%，1.92%

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，按供試品溶液制備方法分別制備樣品溶液，進(jìn)行質(zhì)量比測(cè)定，測(cè)定結(jié)果厚樸酚與和厚樸酚峰面積的RSD值分別為2.22%，2.41%.

加樣回收試驗(yàn)：精密量取樣品共6份，分別加入一定量的厚樸酚與和厚樸酚對(duì)照品，按樣品質(zhì)量比測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2、3.

表2加樣回收率(厚樸酚)(n=3)

試驗(yàn)號(hào)制劑中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.780.801.5798.7520.810.801.62101.2530.790.801.61102.50100.632.3240.800.801.60100.0050.760.801.59103.7560.790.801.5797.50

表3加樣回收率(和厚樸酚)(n=3)

試驗(yàn)號(hào)制劑中的量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.690.671.3497.0120.660.671.35102.9830.690.671.39104.47100.742.7740.690.671.36100.0050.680.671.36101.4960.680.671.3498.51

2.5含大黃總蒽醌量測(cè)定

2.5.1供試品溶液的制備

取2.1項(xiàng)下提取液5 mL，置于圓底燒瓶中，加冰醋酸10 mL，水浴回流30 min，用乙醚洗滌2次，每次15 mL，合并濾液，再加10 mL(6 mol/L)氫氧化鈉和5%氫氧化鈉，2%氫氧化銨混合液5 mL，振搖提取，放置分層，分出紅色堿水層.乙醚層再用混合堿液提取2次，每次20 mL，將提取的堿液至于100 mL容量瓶中，水浴加熱30 min，冷卻至室溫，加混合堿液至刻度.

2.5.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取1.8-二羥基蒽醌2.14 mg，加甲醇使溶解至25 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液.精密量取儲(chǔ)備液3.0 mL置10 mL容量瓶中，水浴蒸去甲醇，加5%氫氧化鈉，2%氫氧化銨混合液至刻度，搖勻后靜置30 min，作為對(duì)照品溶液.

2.5.3最佳吸收波長(zhǎng)的確定

按照2010年版《中國(guó)藥典》附錄VA紫外-可見(jiàn)分光光度法項(xiàng)下操作，取2.5.1項(xiàng)下供試品溶液和2.5.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，在200～800 nm范圍進(jìn)行光譜掃描.由光譜圖2可看出，在523 nm處，有最大吸收，且無(wú)干擾，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為523 nm.

圖2　大黃總蒽醌光譜圖

2.5.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取對(duì)照品0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL至10 mL容量瓶中，水浴蒸去甲醇，加5%氫氧化鈉，2%氫氧化銨混合液至刻度，搖勻后靜置30 min，在523 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.033 9x+0.077 5，R2=0.999 3，線性范圍為4.28～34.24 μg.

2.6正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)L9( 34) 正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn),分別測(cè)定提取液所得出膏率、浸出物及提取液中含厚樸酚與和厚樸酚、及大黃總蒽醌量為水浴回流提取正交試驗(yàn)的主藥考核指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5～8.

表4正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)序號(hào)ABCD出膏率/%浸出物/%含厚樸酚與和厚樸酚總量/mg含大黃總蒽醌量/mg綜合評(píng)分1111115.5026.7330.7619.820.692122221.7527.0939.7030.960.913133324.3126.2564.0947.011.204212319.1826.5642.5624.850.845223122.9323.52118.4749.161.466231217.8626.4738.9335.750.907313224.5724.1661.8544.851.158321316.7827.0444.5615.990.699332123.5426.1277.48300.91K12.82.682.28K23.23.062.66K32.753.013.81R0.450.381.53

綜合評(píng)分=(含厚樸酚與和厚樸酚總量/含厚樸酚與和厚樸酚總量平均數(shù))×0.3+(含大黃總蒽醌量/大黃總蒽醌量平均數(shù))×0.3+(出膏率/出膏率平均數(shù))×0.2+(浸出物/浸出物平均數(shù))×0.2

表5出膏率的方差分析結(jié)果表

因素離均差平方和自由度FP加水量A4.20221.640>0.05回流時(shí)間B7.18622.805>0.05提取次數(shù)C80.979231.608<0.05誤差D2.5622

表6浸出物的方差分析結(jié)果表

因素離均差平方和自由度FP加水量A2.28321.113>0.05回流時(shí)間B0.37620.183>0.05提取次數(shù)C8.23824.015>0.05誤差D2.0522

表7含厚樸酚與和厚樸酚總量的方差分析結(jié)果表

因素離均差平方和自由度FP加水量A774.57220.526>0.05回流時(shí)間B790.37120.537>0.05提取次數(shù)C2908.88621.976>0.05誤差D1472.3332

表8含大黃總蒽醌量方差分析結(jié)果表

因素離均差平方和自由度FP加水量A61.06120.651>0.05回流時(shí)間B95.63921.019>0.05提取次數(shù)C897.32229.565>0.05誤差D93.8112

綜合方差分析結(jié)果，除因素C在出膏率方差分析中差異顯著(P<0.05)之外，其他因素差異均不顯著(P>0.05)，含厚樸酚與和厚樸酚量測(cè)定中，優(yōu)組合為A2B2C3，含大黃總蒽醌量測(cè)定中，優(yōu)組合為A2B2C3，含浸出物量測(cè)定中優(yōu)組合為A1B2C2，出膏率測(cè)定中，優(yōu)組合為A3B1C3.依據(jù)綜合評(píng)分極差C > A > B (R=1.53>0.45>0.38)，故影響試驗(yàn)結(jié)果的主次因素順序?yàn)镃> A > B，即提取次數(shù)影響最大，加水量次之，影響最小的是提取時(shí)間，同時(shí)考慮到節(jié)能、生產(chǎn)實(shí)際等諸方面因素,綜合評(píng)價(jià)確定最佳提取工藝為A2B2C3，即：第一次加水10倍量，回流提取1.5 h，第二次加水8倍量，回流提取1.0 h，第三次加水6倍量，回流提取0.5 h.

2.7驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取10倍處方量藥材三份，按照最佳工藝提取，分別測(cè)定出膏率，浸出物，厚樸酚與和厚樸酚及大黃總蒽醌的量.結(jié)果見(jiàn)表9.

表9提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

試驗(yàn)號(hào)123均值/%RSD/%出膏率/%24.4624.6825.0324.720.5871浸出物/%26.0225.9425.7325.90.5787大黃酚總蒽醌/mg48.5647.9549.6449.721.7567厚樸酚與和厚樸酚/mg116.74119.97117.24117.981.4736

3　結(jié)　語(yǔ)

本文采用現(xiàn)代科學(xué)方法對(duì)厚樸七物湯傳統(tǒng)方劑進(jìn)行提取工藝改革，方中厚樸為君藥，在臨床療效中起著重要作用，大黃蒽醌作用顯著，并且藥物處理過(guò)程簡(jiǎn)單，質(zhì)量比測(cè)定方法明確，故選厚樸中的有效成分厚樸酚與和厚樸酚以及大黃總蒽醌作為含量測(cè)定指標(biāo)性成分，測(cè)定方法確切，具有一定的代表性，與含出膏率、浸出物量綜合評(píng)分，篩選提取工藝條件.結(jié)果表明,該提取工藝條件和方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可行.

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Extraction technology of Houpu Qiwu decoction

ZHANG Wen-wei, WANG Yi, FANG Fang, TIAN Ming

(Teaching Laboratory Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To study the optimal extraction process of Houpu Qiwu decoction, the orthogonal experiment was used. The optimal extraction process was determined with the rate of extraction, the percentage composition of extractive and the content of magnolol, honokil and total anthraquinone in radix et rhizoma rhei as the index. Results indicated that the optimal extraction of Houpu Qiwu decoction was reflux extraction 3 times, the first time of 1.5 h with 10 times water; the second time of 1 h with 8 times water, and the third time of 0.5 h with 6 times water. The optimal extraction technology was easy, high efficiency and stable.

Houpu Qiwu decoction granules; extraction process; magnolol; honokil total anthraquinone in radix et rhizoma rhei

2015-08-28.

張文娓(1982-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中藥新藥研發(fā)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.

田明(1963-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥新藥研發(fā)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.

R284

A

1672-0946(2016)04-0421-05