馮穩(wěn)，張冰，于慶凱[鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院）病理科，河南 鄭州 450003]

臨床論著

核因子E2相關(guān)因子2在肺腺癌中的表達(dá)及臨床意義

馮穩(wěn)，張冰，于慶凱
[鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院）病理科，河南 鄭州 450003]

目的研究核因子E2相關(guān)因子2（以下簡稱轉(zhuǎn)錄因子Nrf2）在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法收集本院胸外科手術(shù)治療的肺腺癌組織標(biāo)本88例，正常肺組織標(biāo)本20例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)組織標(biāo)本中Nrf2的表達(dá)水平。結(jié)果Nrf2在正常肺組織中陽性表達(dá)率低于10%，在肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率為69.3%，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中Nrf2的陽性表達(dá)率為73.3%。低分化組腺癌組Nrf2陽性表達(dá)率（84.6%）明顯高于中分化組（76.4%）和高分化組（70.7%）。結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，與肺腺癌的組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性。

肺；腺癌；Nrf2；免疫組織化學(xué)

肺腺癌（lung adenocarcinoma）是肺癌的一種，屬于非小細(xì)胞癌，是目前臨床常見的肺癌類型，也是非吸煙人群中最常見的肺癌類型[1]。隨著我國工業(yè)化進(jìn)程加快，霧霾等極端惡劣天氣的增多，肺腺癌的發(fā)病率逐年增高且呈年輕化趨勢(shì)，該病早期癥狀較少、發(fā)病迅猛、死亡率高，對(duì)患者身體健康造成嚴(yán)重影響，如何早期診斷及準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腫瘤的分期對(duì)于臨床治療具有十分重要的意義。核因子E2相關(guān)因子2 （nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）（以下簡稱轉(zhuǎn)錄因子Nrf2）是近些年新發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激分子B7家族成員，具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，它廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，卻極少在正常人體組織中表達(dá)[2]，該特性對(duì)腫瘤的治療及預(yù)后具有重要研究價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nrf2在肺腺癌組織中的表達(dá)并研究分析其在肺腺癌診斷及預(yù)后判斷方面的臨床意義。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源

收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 2014年 8月-2015年8月胸外科手術(shù)治療的肺癌組織標(biāo)本88例。其中，男性42例，女性46例；平均（64.31±4.22）歲；低分化13例，中分化34例，高分化41例；所有患者均符合最新肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，來院前均未接受其他治療。收集正常肺組織20例作為對(duì)照，其中女性9例，男性11例；平均（63.42±3.72）歲，無肺系及其他臟器疾病，符合健康人群診斷標(biāo)準(zhǔn)。兩者在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2取材和病理切片的制備

手術(shù)切除新鮮肺組織標(biāo)本后急送病理科，每例患者留取癌組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本各一塊，以甲醛溶液固定24 h以上，制備石蠟包塊，制作連續(xù)切片（厚度4μm，德國Leica切片機(jī)），分別常規(guī)以蘇木素-伊紅（HE）染色、Nrf2免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡（Olympus公司，BX43，日本）下觀察并拍照。

1.3免疫組織化學(xué)染色法

采用Vectastin ABC試劑（VECTOR實(shí)驗(yàn)室，NG EA CLSA），通過生物素-鏈菌卵白素-過氧化酶方法進(jìn)行，切除的組織標(biāo)本用甲醛溶液固定，石蠟包埋，組織切片的厚度為4μm，將其置于玻璃片上，用二甲苯脫蠟，在梯度乙醇內(nèi)水化，在900 w微波加熱2 s，進(jìn)行抗原修復(fù)后，于0.3%的過氧化氫H2O2中浸泡30 min阻斷內(nèi)源性抗原，用PBS洗3次，用10%正常的血清卵育以阻斷背景非特異性的染色，加上一抗置于濕盒內(nèi)孵育一夜。一抗為小鼠抗Nrf2（1∶1000稀釋）（Abcam公司，美國）。用PBS洗后，生物素包被的馬抗鼠抗體孵育30 min后用PBS洗3次，再用卵白素連接的過氧化物酶孵育30 min。與二氨基聯(lián)苯胺（PAD）孵育后觀察，然后用蘇木素復(fù)染。以正常小鼠的IgG代替一抗作為陰性對(duì)照組。

1.4Nrf2的表達(dá)分析

通過光學(xué)顯微鏡分別觀察在胞膜上或和胞漿內(nèi)計(jì)數(shù)陽性染色的細(xì)胞個(gè)數(shù)，分析Nrf2的表達(dá)情況。在×400倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)腫瘤區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。陽性細(xì)胞的密度根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比來進(jìn)行半定量分級(jí)：（-）：表達(dá)<10%；（+）：表達(dá)10%～ 30%；（++）：表達(dá)31%～60%；（+++）：表達(dá)61%～80%；（++++）：表達(dá)>81%。根據(jù)染色情況，將這些標(biāo)本分為兩組：陰性（<10%）；陽性（10%～100%）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS分析軟件包，通過Fisher精確檢驗(yàn)來分析的Nrf2表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Nrf2在肺腺癌組織及正常肺組織中的表達(dá)

在正常肺組織中，幾乎不表達(dá)Nrf2（-）。但是Nrf2在肺腺癌細(xì)胞上的表達(dá)形式非常彌散，在細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)或在兩者內(nèi)均有表達(dá)。在低分化組肺腺癌組織Nrf2陽性表達(dá)（++++），顯著高于中分化肺腺癌（+++）、高分化肺腺癌（++）。隨機(jī)選擇其中的1次檢測(cè)結(jié)果見附圖。

附圖　不同肺組織Nrf2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 （×100）

2.2Nrf2的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性

Nrf2的表達(dá)在肺腺癌患者的年齡、性別、有無吸煙史等因素方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而在腺癌的分化程度、TNM分期等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組織病理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nrf2在20例正常肺組織中陽性表達(dá)率低于10%，在88例肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率為69.5%，在合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的60例肺腺癌組織中Nrf2的陽性表達(dá)率為73.3%。低分化組肺腺癌組織Nrf2陽性表達(dá)率（84.6%）高于中分化組（76.5%）和高分化組（70.7%），P=0.021。見附表。

附表　不同臨床病理因素影響下Nrf2的表達(dá)情況

3　討論

我國每年新增約100萬肺癌患者，80%的病理類型是非小細(xì)胞肺癌，其中又以肺腺癌的發(fā)病率上升最為明顯，目前約占40%以上[4]，多好發(fā)于女性及無吸煙史患者，目前發(fā)病率已居世界首位，嚴(yán)重威脅人類健康[5-6]。早期診斷是防治此病的關(guān)鍵，目前隨著生物技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)肺腺癌的檢測(cè)手段層出不窮，提高了臨床診斷率。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要是T淋巴細(xì)胞，而在T細(xì)胞活化、耐受的免疫調(diào)節(jié)過程中，B7-CD28家族成員介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞共刺激信號(hào)傳導(dǎo)途徑起著至關(guān)重要的作用，它既可以正性調(diào)節(jié)增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，也可以負(fù)性調(diào)節(jié)減弱T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對(duì)于各種腺癌的治療及預(yù)后具有重要的參考價(jià)值[7]。NRF2是最新發(fā)現(xiàn)的B7-CD28家族一員，人Nrf2位于第9號(hào)染色體15q 24.1，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)顯子組成，位于一個(gè)具有免疫調(diào)節(jié)功能的基因座內(nèi)[8]?？梢酝ㄟ^與靶細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控的功能，在癌組織中異常表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。本課題研究結(jié)果顯示，Nrf2在20例正常肺組織切片中陰性表達(dá)，而在88例肺腺癌組織標(biāo)本中有69.3%的陽性表達(dá)率，這表明Nrf2表達(dá)升高可以提示腫瘤的發(fā)生，可以作為檢測(cè)腺癌的一個(gè)重要標(biāo)記物。據(jù)近幾年的研究表明，Nrf2分子異常表達(dá)于肺癌、膀胱癌等組織內(nèi)，與腫瘤的預(yù)后有相關(guān)性[9-10]。Nrf2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并可負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，雖然其確切的機(jī)制尚不明確，但本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的60例肺腺癌組織中Nrf2的陽性表達(dá)率為73.3%，在低分化組肺腺癌組織Nrf2陽性表達(dá)率為84.6%，顯著高于中分化（76.5%）及高分化組（70.7%）。提示Nrf2表達(dá)水平與患者的年齡、性別、有無吸煙等無關(guān)，而與腺癌細(xì)胞的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。根據(jù)最新研究[11-13]證實(shí)，Nrf2在肺癌、肝癌、胰腺癌中的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小無相關(guān)性，而與生存期、腫瘤浸潤程度、腫瘤組織類型相關(guān)，另據(jù)Zhou等[14]研究表明，Nrf2強(qiáng)表達(dá)的肝癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時(shí)間早，患者生存期短。Sasaki 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因突變與肺癌的預(yù)后有關(guān)。因此筆者推測(cè)在肺腺癌的診斷方面Nrf2具有獨(dú)特的生物標(biāo)記價(jià)值，有可能會(huì)成為評(píng)價(jià)肺腺癌分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。

綜上所述，Nrf2具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，與肺腺癌的組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性，可以作為肺腺癌疾病診斷及預(yù)后的重要參考指標(biāo)之一，但對(duì)Nrf2在腫瘤組織發(fā)生、發(fā)展過程的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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（張蕾編輯）

臨床論著

Expression and clinical significance of Nrf2 in pulmonary adenocarcinoma

Wen Feng，Bing Zhang，Qing-kai Yu
（Cancer Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Henan Provincial Cancer Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To study the expression and clinical significance of signal molecule Nrf2 in pulmonary adenocarcinoma tissues.Methods 88 tissue samples of pulmonary adenocarcinoma and 20 normal lung tissues were collected as research subject.The expressions of Nrf2 in lung tissues were identified by immune histochemistry. Results The positive expression rate of Nrf2 was less than 10%in normal lung tissue，while it was 69.3%in tissue samples of pulmonary adenocarcinoma，and 73.3%in samples combined with metastasis of lymph nodes.The positive expression rate of Nrf2 was higher in poorly differentiated group（84.6%）than that in middle（76.4%）and high differentiation group（70.7%）.Conclusion The expression of Nrf2 was upregulated in tissues of pulmonary adnocarcinoma，and it was related with the degree of differentiation and lymph node metastasis of lung adenocarcinoma.

lung；adenocarcinoma；Nrf2；immune histochemistry

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.006

1005-8982（2016）04-0029-04

2015-09-08

于慶凱，E-mail：yuqingkai@hotmail.com