江青山，譚俞佳，鄧珊（南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻喉科，湖南 衡陽 421001）

論著

S100A4真核表達載體構(gòu)建及對鼻咽癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響*

江青山，譚俞佳，鄧珊
（南華大學附屬第一醫(yī)院 耳鼻喉科，湖南 衡陽 421001）

目的構(gòu)建S100A4穩(wěn)定高表達的鼻咽癌細胞株，研究S100A4與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系。方法PCR方法擴增S100A4片段，將產(chǎn)物插入pCMV載體，將重組質(zhì)粒及其空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細胞CNE2；MTT法繪制細胞生長曲線，Western blot檢測S100A4、E-cadherin、Fibronectin、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的表達；Transwell實驗檢測細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。結(jié)果成功構(gòu)建了S100A4穩(wěn)定高表達的重組細胞株；細胞生長曲線表明S100A4穩(wěn)定高表達的重組細胞株生長較快；S100A4穩(wěn)定高表達的重組細胞株中E-cadherin、Fibronectin低表達而MMP2、MMP9高表達；Transwell實驗發(fā)現(xiàn)S100A4穩(wěn)定高表達的重組細胞株的侵襲細胞計數(shù)明顯高于空白載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組（P>0.01）。結(jié)論S100A4能調(diào)控鼻咽癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，并上調(diào)MMP2、MMP9表達而促進鼻咽癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

鼻咽腫瘤；S100A4；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；基質(zhì)金屬酶蛋白；侵襲轉(zhuǎn)移

鼻咽癌（nasophargngenl carcinoma，NPC）發(fā)病具有地域特點，我國南方地區(qū)是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)域，其發(fā)病部位比較隱蔽，容易早期發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。臨床上鼻咽癌患者化療和放療治療效果均不理想，其5年生存率約50%[1]。鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復雜過程，其分子機制包括腫瘤細胞接觸性抑制的喪失、運動性的增加和細胞外基質(zhì)的降解等[2]。S100A4是一種低分子質(zhì)量的鈣結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，S100A4參與細胞增殖、分化、信號傳導、細胞黏附、胞外基質(zhì)重建及細胞運動等多種生命活動。其與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后差密切相關(guān)[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，S100A4與腫瘤生物學行為的關(guān)系密切，但作用機制尚未完全闡明。本研究擬對S100A4在鼻咽癌中的作用進行探討，現(xiàn)報道如下：

1　材料與方法

1.1材料

人鼻咽癌CNE2細胞株購自中南大學細胞中心。改良型1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，DMSO購自德國Applichem公司，胰酶、G418及GIMSA染液購自Solarbio公司，pCMV載體購自上海碧云天有限公司，E-cadherin、Fibronectin、基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix metallopeptidase 2，MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metallopeptidase 9，MMP9）單克隆抗體購自美國Sant Cruz公司。

1.2方法

1.2.1pCMV-S100A4真核表達載體的構(gòu)建①細胞總RNA的提?。寒敿毎L至80%～90%匯合時，收集細胞加Trizol冰上裂解。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)體系為 10μl：5×Primer ScriptBuffer 2μl；Primer Script RT Enzyme Mix 0.5μl；Random 6 mers 0.5μl；OligodT Primer 0.5μl；Total RNA 1μl；dH2O 5.5μl；反應(yīng)條件為：37℃ 30 min，85℃ 5 min。③PCR反應(yīng)：S100A4正向引物：5'-CGGCTCGAGGAGA AGGCCCTGGATGTGATG-3'；反向引物：5'-CGGGAT CCACCTCGTTGTCCCTGTTGCTG-3'。PCR反應(yīng)體系為25μl：Taq Master Mix 12.5μl；PCR正向引物1.0μl；PCR反向引物 1.0μl；cDNA2.0μl；dH2O 8.5μl；反應(yīng)條件如下：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃30s，35個循環(huán)，72℃ 45s，72℃ 5min。④重組DNA的構(gòu)建：將目的DNA片段采用雙酶切法插入，PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染感受態(tài)JM109菌，擴增后挑取陽性克隆送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2重組細胞系的建立1×103個/ml對數(shù)生長期細胞接種于24孔板，50μl培養(yǎng)基中加入質(zhì)粒DNA 1.5μg，柔和混勻，再將稀釋好的質(zhì)粒DNA和LipofectamineTM2000輕柔混勻，室溫放置20min。常規(guī)培養(yǎng)4~6 h后轉(zhuǎn)染，72 h后改用G418持續(xù)篩選14d，挑出陽性單克隆擴大培養(yǎng)。獲得2個重組細胞系：pCMV（+）-S100A4-CNE2細胞和 pCMV（-）-empty-CNE2，以未轉(zhuǎn)染組（Control）為空白對照組。1.2.3Western blot檢測Western blot收集不同細胞，加入含PMSF的RIPA裂解液（1 ml裂解液加入100mmol/L PMSF 10μl），BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，制備好的樣品置于-20℃冰箱保存；用槍在加樣孔中加入蛋白樣品及蛋白Marker進行電泳；將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，恒壓87 V轉(zhuǎn)膜1.5 h；麗春紅染色2 min；含有5%脫脂奶粉的封閉液，室溫封閉1 h；TBST洗滌，加入一抗緩沖液（S100A4抗體，1∶3 000；β-actin抗體，1∶3 000），4℃孵育過夜；TBST洗滌，加入二抗緩沖液（1∶3 000），室溫封閉1h；TBST洗滌，10min×3次，ECL化學發(fā)光法顯影，使用Alpha Innotech系統(tǒng)進行掃描及分析。

1.2.4細胞生長曲線繪制分別收集處于對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞，制成單細胞懸液。常規(guī)接種培養(yǎng)于24孔板中，每孔中加入1ml含10%小牛血清的培養(yǎng)基，最后調(diào)整細胞密度為104個/ml。每24h用胰酶消化后收集其中3孔的細胞，進行細胞計數(shù)。MTT法連續(xù)7d對活細胞進行計數(shù)。以日期作為X軸，細胞計數(shù)作為Y軸，繪出鼻咽癌細胞株的生長曲線。1.2.5Transwell侵襲實驗用RPMI 1640無血清培養(yǎng)基1∶100稀釋人工基底膜（Matrigel），浸泡上室約5min，加入100μl稀釋的Matrigel；在侵襲小室腔的上下室分別加入200μl、600μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基；調(diào)整細胞數(shù)為12.5×104/ml，下室中加入600μl含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，上室中加入200μl細胞懸液，孵育40 h；結(jié)晶紫染色，自來水漂洗；用棉簽輕輕擦拭掉聚碳酯膜上表面的細胞，顯微鏡下計數(shù)穿過聚碳酯膜的細胞，觀察8個高倍視野（×200），實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩兩比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1PCR結(jié)果

采用PCR擴增得到S100A4的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物大小約200 bp，與S100A4基因片段194bp基本一致（見圖1A）。酶切鑒定：重組質(zhì)粒pCMV-S100A4雙酶切結(jié)果大小約4 300 bp 和317 bp的兩個片段，分別代表線性化pCMV質(zhì)粒和插入的S100A4目的片段（見圖1B）。經(jīng)上述PCR和酶切鑒定正確的陽性克隆菌液送上海生物技術(shù)有限公司進一步測序鑒定，測序結(jié)果證實成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-S100A4。

2.2重組細胞系的建立

將重組質(zhì)粒pCMV-S100A4轉(zhuǎn)染到鼻咽癌CNE2細胞，G418篩選，建立pCMV（+）-S100A4-CNE2細胞和pCMV（-）-empty-CNE2細胞系，Western blot檢測S100A4蛋白在重組細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白在pCMV（+）-S100A4-CNE2中高表達（見圖2）。

2.3生長曲線變化

觀察S100A4蛋白表達對CNE2細胞生長、增殖的影響，發(fā)現(xiàn)pCMV（+）-S100A4-CNE2中高表達S100A4能促進腫瘤細胞生長（見圖3）。

2.4EMT轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白檢測

通過Western blot檢測上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin），間質(zhì)標志物纖黏蛋白（Fibronectin）改變，發(fā)現(xiàn)pCMV（+）-S100A4-CNE2中E-cadherin 和Fibronectin表達下調(diào)（見圖4，P<0.01）。說明S100A4高表達能抑制E-cadherin和Fibronectin的表達而影響腫瘤細胞的EMT過程。

圖1　PCR結(jié)果

圖2　S100A4蛋白在重組細胞系中表達情況

圖3　S100A4蛋白表達對CNE2細胞生長的影響

圖4　重組細胞系中E-cadherin和Fibronectin表達變化

2.5Transwell侵襲細胞計數(shù)

觀察腫瘤細胞侵襲能力的改變：pCMV（+）-S100A4-CNE2侵襲細胞計數(shù)明顯高于pCMV（-）empty-CNE2細胞和CNE2細胞（見圖6和附表，P<0.01）。

轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：pCMV（+）-S100A4-CNE2中MMP2、MMP9表達增高（見圖5，P<0.01），說明S100A4能通過提高MMP 2、MMP9表達促進鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移。

圖5　重組細胞系中MMP2、MMP9表達變化

圖6　Transwell侵襲細胞計數(shù)

附表　Traswell侵襲細胞計數(shù)

3　討論

S100A4蛋白S-100蛋白家族的成員之一，是一種鈣結(jié)合蛋白，其氨基酸序列具有EF雙螺旋結(jié)構(gòu)，可與鈣離子高親和性結(jié)合。當該EF結(jié)構(gòu)域與鈣離子結(jié)合后，S100A4蛋白的三維分子構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出其結(jié)合位點，可與反向靶蛋白進行結(jié)合，在細胞的運動、侵襲、轉(zhuǎn)移以及凋亡等生物學過程中具有重要作用[5]。已有不少研究證實，S100A4在多種惡性腫瘤組織，如結(jié)腸癌、胰腺癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、肝癌等腫瘤中高表達[6-10]，其高表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，S100A4在正常結(jié)腸黏膜上皮中無或弱表達，在結(jié)腸癌組織中呈陽性表達，且S100A4的表達與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]；有人通過RT-PCR技術(shù)檢測胰腺癌中S100A4 mRNA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細胞中S100A4 mRNA呈過表達；而免疫組織化學結(jié)果顯示93%的有侵襲行為的胰腺癌表達S100A4，正常組織及慢性胰腺炎組織均不表達S100A4，胰腺癌中S100A4蛋白的表達與腫瘤不良分化顯著相關(guān)[7]；有研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移能力的黑色素瘤細胞株中，S100A4表達明顯高于低轉(zhuǎn)移能力的細胞株，S100A4高表達是導致黑色素瘤細胞高轉(zhuǎn)移能力的重要原因之一[8]；S100A4蛋白在鼻咽癌中表達升高，與淋巴結(jié)N分期和臨床分期密切相關(guān)，有望成為判斷鼻咽癌惡性生物學行為的有效指標[11]。

近年來，為進一步研究S100A4基因在腫瘤中的作用，有人通過將S100A4基因轉(zhuǎn)染小鼠B16細胞系和MCF-7細胞系后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的兩種腫瘤細胞發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的概率明顯增加[12]；有學者用S100A4 siRNA轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞株后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中S100A4表達明顯減少，并且下調(diào)CD44和MMP2，可能是通過影響細胞基質(zhì)黏附能力下降來影響腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13]。以上研究表明，S100A4高表達能促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可能是一種腫瘤轉(zhuǎn)移促進基因，抑制其表達可能是一種有效的分子靶向治療策略。

為進一步研究S100A4在鼻咽癌中的作用，本研究成功構(gòu)建S100A4高表達重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進鼻咽癌細胞株后，發(fā)現(xiàn)，重組細胞株中S100A4蛋白高表達，生長曲線檢測高表達S100A4能促進腫瘤細胞生長。研究結(jié)果表明，S100A4高表達能促進鼻咽癌增殖。與上述研究結(jié)果一致。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程。在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、腫瘤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用，其主要的特征有細胞黏附分子E-cadherin和間質(zhì)標志物Fibronectin表達的減少[14]。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌中，S100A4高表達和E-cadherin低表達與肝細胞癌的侵襲有關(guān)，E-cadherin是肝癌的預(yù)后因子[15]。乳腺癌中S100A4和MMP13表達具有相關(guān)性，過表達S100A4能引起MMP13表達增加，而干擾S100A4表達后，MMP13表達下調(diào)且腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力下降[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，S100A4轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞株后獲得的重組細胞系中，S100A4表達增高，而E-cadherin和Fibronectin表達下調(diào)，說明高表達S100A4可能通過抑制E-cadherin和Fibronectin的表達來影響鼻咽癌的EMT過程，增強腫瘤細胞的遷移和運動能力，從而進一步影響鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移除了首先發(fā)生EMT獲得細胞活動能力增強外，還必須排除細胞外基質(zhì)的阻礙，而基質(zhì)金屬蛋白酶則是降解細胞外基質(zhì)的主要水解酶類[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，S100A4高表達的重組細胞系中MMP2、MMP9表達增高；同時，Transwell實驗表明，pCMV（+）-S100A4-CNE2中侵襲細胞計數(shù)高于空白載體對照組和未轉(zhuǎn)染組，說明S100A4能通過提高MMP2、MMP9表達，降解細胞外基質(zhì)，從而促進鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，本研究成功構(gòu)建S100A4高表達的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染進鼻咽癌細胞株，構(gòu)建S100A4穩(wěn)定高表達的重組細胞系，研究還發(fā)現(xiàn)，S100A4高表達能促進鼻咽癌細胞增殖；下調(diào)E-cadherin和Fibronectin的表達，降解細胞外基質(zhì)，影響鼻咽癌的EMT過程，增強鼻咽癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。S100A4在鼻咽癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。

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（張蕾編輯）

Establishment of S100A4 eukaryotic expression vector and the effects to metastasis and invasion of NPC*

Qing-shan Jiang，Yu-jia Tan，Shan Deng
（Department of ENT，Clinical Research Institute，the First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China）

Objective To build a stable cell line with S100A4 high expression and study the relationship between S100A4 and metastasis and invasion of nasopharyngeal carcinoma（NPC）.Methods To amplify the fragment of S100A4 by PCR method，and PCR products were inserted into pCMV vector.The reconstructed pCMV-S100A4 vector and empty vector were transferred into CNE2 cell line.Then the growth curve were drown by MTT method.The expression of S100A4，E-cadherin，F(xiàn)ibronectin，MMP2（matrix metallopeptidase 2）and MMP9（matrix metallopeptidase 9）were detected by Western blot.And the changes of ability of metastasis and invasion were examined by Transwell.Results Succeed to build a stable cell line with S100A4 high expression；The grow curves showed that the growth speed were more quickly in pCMV-S100A4-CNE2 than in pCMV-empty-CNE2 and CNE2.Western blot results showed that there were low expression of E-cadherin、Fibronectin and high expression of MMP2，MMP9 in pCMV-S100A4-CNE2 than in pCMV-empty-CNE2 and CNE2.Transwell results showed that there were more invaded cells in pCMV-S100A4-CNE2 than in pCMV-empty-CNE2 and CNE2（P＜0.01）.Conclusions S100A4 can regulate the process of EMT in NPC and upregulate the expression of MMP2 and MMP9 to promote the metastasis and invasion of NPC cells.

NPC；S100A4；EMT；MMP；invasion and metastasis

R 739.63；R 392.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.002

1005-8982（2016）04-0005-06

2015-09-30

湖南省科技廳資助項目（No：2012SK3159）