王剛，解寒冰（河南省鄭州人民醫(yī)院 .急診科，.普通外科，河南 鄭州 450003）

臨床論著

microRNA-221在結直腸癌中的表達及其對癌細胞遷移的影響

王剛1，解寒冰2
（河南省鄭州人民醫(yī)院 1.急診科，2.普通外科，河南 鄭州 450003）

目的研究上皮-間質轉化（EMT）相關的微小R NA（microR NA，以下簡稱miR NA）-221在結直腸癌患者中的表達水平，并探索其對結直腸癌細胞遷移水平的影響。方法選取該院40例結直腸癌患者為研究組，選取同期體檢的40例健康人群為對照組。采用實時定量R T-PCR法檢測結直腸癌患者癌組織以及癌旁組織中miR NA-221表達水平，同時對比結直腸癌患者及正常人血漿中miR NA-221表達水平。對結直腸細胞采用miR NA-221的mimic及inhibitor分別高、低表達miR NA-221后，采用transwell法分別檢測細胞的侵襲水平以及EMT相關蛋白表達。結果miR NA-221在直腸癌組織的表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；miR NA-221在直腸癌患者血漿中的表達水平顯著高于健康對照人群，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。干擾結直腸癌HT-29細胞株中miR NA-221后，結直腸癌細胞遷移能力顯著降低（均P<0.05），且細胞中EMT相關的上皮鈣黏蛋白（E-cad）的表達水平降低；而過表達HT-29細胞株中miR NA-221，結直腸癌細胞遷移能力顯著增加，且細胞中EMT相關的上皮鈣黏蛋白（E-cad）的表達水平增加。結論結直腸癌患者高表達的miR NA-221通過促進結直腸癌細胞的遷移水平來參與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的進程。

microR NA-221；結直腸癌；上皮鈣黏蛋白；遷移

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球消化道最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)WHO國際癌癥研究機構數(shù)據(jù)顯示，近年來，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢[1]。而在中國，由于飲食結構西方化、生活行為方式改變及精神緊張等很多因素，結直腸癌死亡率居惡性腫瘤第5位[2-3]。因此，研究結直腸癌的發(fā)病機制對結直腸癌的預防和治療有著重要的臨床意義。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞發(fā)生轉化的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，EMT現(xiàn)象與腫瘤的侵襲、轉移等密切相關，在多種癌癥的原位浸潤和遠處轉移中發(fā)揮著極其重要作用[4]。

微小RNA（microRNA，以下簡稱miRNA）是一類新近發(fā)現(xiàn)的長度約為22個核昔酸的非編碼單鏈小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的EMT過程中發(fā)揮著重要的作用：miRNA-194能夠通過靶向FoxM1抑制胃癌的EMT過程[5]；miRNA-124通過調節(jié)TNF-a參與調節(jié)前列腺癌的EMT[6]；高表達的miRNA-9參與乳腺癌的EMT過程[7]。miRNA-221是一類近年來發(fā)現(xiàn)的與前列腺癌EMT中密切相關的新分子[8]。然而到目前為止，EMT相關的miRNA-221在結直腸癌患者組織及血漿內(nèi)的表達水平以及對結直腸癌細胞潛在作用的研究報道尚少。本研究對比了miRNA-221在結直腸癌患者組織及血漿內(nèi)的表達水平，并觀察其對結直腸癌細胞的遷移能力的影響。

1　材料與方法

1.1臨床資料

所有組織樣本來源于2013年1月-2015年1月鄭州人民醫(yī)院行手術治療的40例結直腸癌患者的手術切除標本，病理診斷均為結直腸癌?；颊吣挲g23～69歲。術前均未接受化療、放療。癌組織標本離體時間控制在30 min內(nèi)，并分別取癌旁組織（距離癌組織大約4 cm）。對照組選取本院體檢的正常40例健康人群，年齡22～63歲。其中，男性16例，女性24例。兩組人群在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性（P>0.05）。

1.2實驗方法

1.2.1組織以及血漿標本總R NA提取、逆轉錄反應及檢測清晨空腹時抽取正常人群與結直腸癌患者5 ml外周靜脈血，加入EDTA抗凝劑，2 h內(nèi)于4℃條件下4000r離心5min。離心后提取上層血漿

放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。結直腸癌組織及癌旁組織手術切除標本取出后立即放入液氮，并儲存于-80℃冰箱?？俁NA提取、逆轉錄反應及實時定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）：取約100mg組織或100μl血漿，加入1 ml Trizol（購于美國Gibco公司）后采用勻漿儀進行勻漿，抽提總RNA，所得RNA溶于20μl的DEPC水中，采用逆轉錄試劑盒（Thermo Fisher公司）對所抽提的RNA進行逆轉錄得到cDNA。PCR反應條件：95℃變性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s進行40個循環(huán)。miRNA-221探針引物：5'-GAAACCCAG CAGACAATGTAGCT-3'[9]；U6內(nèi)參：5'-CTCGCTTCG GCAGCACA-3'以及5'-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3'。PCR使用ABI公司的7300型號Real-Time PCR儀器，結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析[10]。

1.2.2細胞轉染人大腸癌細胞株HT-29（上海拜力生物科技有限公司）采用高糖DMEM（美國Hyclone公司）+10%FBS（美國Gibico公司）傳代培養(yǎng)，如圖1所示。待HT-29細胞匯合率生長到60%～70%左右時，采用脂質體2000（美國Invitrogen公司）對株HT-29分別采用miRNA-221的mimic及inhibitor轉染，高、低表達miRNA-221，于48 h檢測其干擾效率。miRNA-221的模擬物與抑制物由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。分組情況：A組空白組（未加任何序列質粒）；B組對照組（加入對照無意義序列）；C組實驗組（mimic及inhibitor轉染組）。

圖1　細胞培養(yǎng)圖 （×200）

1.2.3細胞遷移實驗取對數(shù)生長期HT-29細胞制備細胞懸液，調整細胞密度至5×l05個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell（美國Corning公司）小室的上層，小室下層加入1ml的10%血清的培養(yǎng)液（完全DMED）。培養(yǎng)24h時間后，取出transwell小室，吸去上層的培養(yǎng)液，使小室于室溫下自然干燥。無水乙醇固定后，采用0.1%結晶紫于室溫下染色30min，倒置顯微鏡（德國蔡司，CFM-500）下觀察己遷移至小室下層的細胞。隨機選取5個視野（×200倍），計數(shù)小室下層的細胞數(shù)。本實驗重復3次，每次每樣三復孔。

1.3免疫印跡檢測蛋白水平

轉染后收集HT-29細胞，加入1×SDS細胞裂解液，SDS-PAGE電泳，120 V電壓轉膜100 min，37℃封閉 80 min，加兔抗人的上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）（美國Cell Signaling公司）4℃孵育過夜后，HRP標記的小鼠抗兔二抗（南京生興生物）（1∶2000稀釋）37℃孵育30min，ECL發(fā)光檢測。內(nèi)參蛋白選用Sigma公司的兔抗人β-actin （1∶3 000稀釋）。用Image-Pro-plus圖像分析軟件系統(tǒng)對蛋白條進行掃描并分析結果，以β-actin為參照，E-cad表達的相對含量以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。觀測資料均為計量數(shù)據(jù)，經(jīng)正態(tài)性檢驗通過，以均數(shù)±標準差（±s）描述。多組間的比較，為單因素方差分析+LSD多重比較；兩組間的差異比較，為成組t檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1結直腸癌患者組織中miRNA-221 mRNA的表達水平

miRNA-221 mRNA在結直腸患者組織中的表達水平為（3.02±1.19），顯著高于癌旁組織的（1.18±0.27），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.682，P= 0.000）。

2.2結直腸癌患者血漿中miRNA-221 mRNA的表達水平

結直腸癌患者血漿中miRNA-221 mRNA表達水平為（3.18±1.81），顯著高于正常健康人群的（1.31±0.53），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.345，P= 0.000）。

2.3低表達miRNA-221對結直腸癌細胞遷移能力及EMT相關蛋白水平影響

由表1可見，3個指標的3個組間整體差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。遂進行多重比較，比較結果顯示：結直腸癌細胞轉染miRNA-221的抑制物（inhibitor）后，miRNA-221的mRNA水平顯著降低（P<0.05）（見圖2A）。低表達結直腸癌細胞中miRNA-221后，HT-29細胞的遷移能力顯著降低（P<0.05）（見圖2B）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與轉染對照組比較，低表達miRNA-221的結直腸癌細胞中EMT相關的上皮鈣黏蛋白（E-cad）的表達水平降低（圖2C、2D），差異也有顯著性意義（P<0.05）。

2.4高表達miRNA-221對結直腸癌細胞遷移能力及EMT相關蛋白水平影響

由表2可見，3個指標的3個組間整體差異也均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。再進行多重比較，比較結果顯示：結直腸癌細胞轉染miRNA-221的模擬物（mimic）后，miRNA-221的mRNA水平表達增加（見圖3A），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高表達結直腸癌細胞中miRNA-221后，HT-29細胞且遷移能力也顯著增加（見圖3B）（P<0.05）。此外，與轉染對照組比較，過表達miRNA-221的結直腸癌細胞中EMT相關的E-cad的表達水平增加（見圖3C、3D），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1　干擾miRNA-221對結直腸癌細胞遷移影響比較

表2　過表達miRNA-221對結直腸癌細胞遷移影響比較

圖2　低表達miRNA-221對結直腸癌細胞遷移能力及EMT相關蛋白水平影響

圖3　高表達miRNA-221對結直腸癌細胞遷移能力及EMT相關蛋白水平影響

3　討論

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病與生活方式、遺傳及大腸腺瘤等關系密切。結直腸癌的發(fā)生及發(fā)展是一個多因素、復雜的過程，而腫瘤轉移是結直腸癌高死亡率的主要原因之一[11]。結直腸癌的EMT過程包含細胞骨架重排、上皮細胞解除細胞間黏附結構及細胞極性改變等，導致細胞變形、伸出絲狀偽足及細胞極性的喪失等，從而在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮極其重要的作用[12]。因此，尋找特異性早期診斷EMT相關的分子標志物（如基因標志）以及基因靶向治療的新策略成為結直腸癌的基礎與臨床研究的熱點問題。

microRNA（miRNA）通過引起特異靶mRNA降解抑制蛋白合成，在轉錄后水平負性調控特異基因表達，是一種新的基因表達調控分子。研究認為，miRNAs既可作為癌基因又可作為抑癌基因，廣泛參與腫瘤細胞的侵襲、轉移等多種病理過程[13-17]。大量的研究認為，miRNA在結直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷和預后等方面發(fā)揮重要作用[11，18-19]。Hansen等[11]發(fā)現(xiàn)在結直腸癌細胞系中miRNA-126顯著上調，并與結直腸癌的轉移密切相關。而Geng等[20]發(fā)現(xiàn)，miRNA-103在結直腸癌組織中表達上調，且能夠促進結直腸癌的遷移。然而至今，結直腸癌患者中miRNA-221的表達水平及其功能的研究尚少報道。

本結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-221在結直腸癌患者組織中表達水平顯著高于癌旁組織，且miRNA-221在結直腸癌患者血漿中的表達水平高于正常人群，說明了miRNA-221在結直腸癌患者中可能參與結直腸癌的發(fā)生、進展和轉移。Qin等[21]學者發(fā)現(xiàn)miRNA-221在結直腸癌細胞系HT29中高表達，且其可以通過靶向RECK分子促進結直腸癌細胞的轉移；從另一方面支持了本研究在結直腸癌組織中的結果。

此外，結果還發(fā)現(xiàn)，低表達miRNA-221的結直腸癌細胞的遷移水平顯著降低，而高表達miRNA-221的結直腸癌細胞的遷移水平顯著增加，表明miRNA-221能夠促進結直腸癌細胞的遷移，從而提示了miRNA-221可能通過影響結直腸癌細胞的遷移參與結直腸癌的進程，這與Qin等[23]研究的結果一致[21]。研究表明，直腸癌的EMT過程在分子生物學方面典型表現(xiàn)為E-cad蛋白等上皮標志物的缺失或減弱。本研究結果亦發(fā)現(xiàn)，低表達miRNA-221的結直腸癌細胞的EMT相關蛋白E-cad表達水平顯著降低；而高表達miRNA-221的結直腸癌細胞中EMT相關蛋白E-cad表達水平顯著增加，從而提示了miRNA-221可能通過調控E-cad來參與結直腸癌的EMT進程。

綜上所述，miRNA-221在結直腸癌中可能發(fā)揮促進腫瘤的功能，其主要是通過影響乳結直腸癌細胞的遷移來參與腫瘤的進程，并與結直腸癌的EMT相關蛋白E-cad密切有關。結直腸癌患者組織及血漿中miRNA-221的檢測對結直腸癌的臨床治療及預后可能具有一定的指導意義。

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（張蕾編輯）

Expression of microRNA-221 in colorectal carcinoma and its impact on cancer cells'migration

Gang Wang1，Han-bing Xie2
（1.Department of Emergency Medicine；2.Department of General Surgery，Zhengzhou People's Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To study miRNA-221 expression in colorectal tissue and plasma of cancer patients，and to explore the mechanism about its migration of colorectal cancer.Methods 40 cases of colorectal cancer patients in our hospital as the study group，40 cases of healthy people as the control group，we used RT-PCR to detect the mRNA levels in peripheral blood or tissue between of two groups；in addition，after overexpression or knockdown of microRNA-221，we detected the migration of cancer cells.Results The expression of microRNA-221 in colorectal cancer tissues was significantly higher than the adjacent tissues（P＜0.05）；in addition，the expression of microRNA-221 in plasma of colorectal cancer patients was significantly higher than the normal population（P＜0.05）.Knockdown of microRNA-221 in colorectal cancer cell line reduced cell invasion and E-cad expression significantly（P＜0.05）；whereas overexpression of microRNA-221 in colorectal cancer cell line improved cell invasion and E-cad expression significantly（P＜0.05）.Conclusion High expression of microRNA-221 in colorectal cancer patients participated in the development of colorectal cancer by promoting the migration of colorectal cancer cells.

microRNA-221；colorectal cancer；E-cad；migration

R 735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.04.012

1005-8982（2016）04-0058-06

2015-11-16