汪開毓劉韜曾宇鯤劉紹春

（1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心 成都 郵編 611130 2 北京漁美康生物技術(shù)有限公司 北京 郵編 102300）

魚類出血性疾病的分析與防控關(guān)鍵技術(shù)

汪開毓1劉韜1曾宇鯤1劉紹春2

（1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心 成都 郵編 611130 2 北京漁美康生物技術(shù)有限公司 北京 郵編 102300）

汪開毓，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院院長，教授，主要從事水生動(dòng)物疾病學(xué)研究。主編、副主編和參編《現(xiàn)代禽病診斷與防治全書》、《水生動(dòng)物病害學(xué)（全國統(tǒng)編教材）》、《新編漁藥手冊(cè)》、《魚病防治與安全用藥》、《養(yǎng)魚全書》、《動(dòng)物病理學(xué)》、《魚病防治手冊(cè)》、《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥處方大全》、《斑點(diǎn)叉尾鮰疾病彩色診療圖譜》、《魚類疾病彩色診療圖譜》等專著和教材11部。

魚類出血性疾病是我國淡水池塘魚類養(yǎng)殖中危害種類最多、流行地區(qū)最廣、發(fā)病率最高、經(jīng)濟(jì)損失最大的一類疾病。魚類出血病是指由致病因子引起的以出血為特征的一類魚病，致病因子一般包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲、應(yīng)激和藥物中毒等多種因素。因此本文就魚類出血性病有關(guān)的病理學(xué)概念和發(fā)病機(jī)制做了簡要介紹，并根據(jù)不同病因和癥狀提出了魚類出血性疾病不同的防治方案，以期為臨床上更好的研究和防治該類疾病提供基礎(chǔ)。

1 出血和出血病概述

1.1 出血和魚類出血病概念

血液自心和血管的腔隙中流出的現(xiàn)象，稱為出血。流出的血液進(jìn)入體腔或組織內(nèi)則稱為內(nèi)出血，反之為外出血。異育銀鯽的“鰓出血”病最為典型的癥狀即為鰓部外出血，而羅非魚鏈球菌則能引起肝臟的內(nèi)出血。按照血液逸出的機(jī)制可將出血分為破裂性出血和漏出性出血兩種。魚類破裂性出血的原因有機(jī)械性創(chuàng)傷，如刺傷或咬傷；有侵蝕性損傷，如炎癥、腫瘤、潰瘍、壞死等過程。漏出性出血是由于毛細(xì)血管后靜脈、毛細(xì)血管以及毛細(xì)血管前動(dòng)脈的血管壁通透性增高，血液通過擴(kuò)大的內(nèi)皮細(xì)胞間隙和受損的血管基底膜而漏出于管腔外的。魚類皮膚、黏膜、漿膜和實(shí)質(zhì)器官的點(diǎn)狀出血所形成的瘀點(diǎn)或瘀斑則是漏出性出血的表現(xiàn)，如鰻鱺紅點(diǎn)病、嗜水氣單胞菌、魚類應(yīng)急性出血癥等。除感染引起的魚類漏出性出血外，其它引起魚類漏出性出血的常見病因還有：維生素C等缺乏引起血管基底膜破裂；毛細(xì)血管膠原減少可致血管通透性升高；某些藥物引起機(jī)體變態(tài)反應(yīng)性血管炎；重金屬（磷、砷、銅）中毒引起的出血；缺氧對(duì)毛細(xì)血管壁可造成直接損傷等。

出血是在許多異常情況下出現(xiàn)的一種非常廣泛和常見的病理現(xiàn)象，出血不一定是疾病，但出血病一定有出血，如池塘起網(wǎng)過程中，鰱受拉網(wǎng)應(yīng)激，魚體表現(xiàn)出片狀或點(diǎn)狀的出血，此種情景下的鰱雖有出血表現(xiàn)，卻不能認(rèn)定為出血病，因?yàn)閼?yīng)激因素消除，鰱即可恢復(fù)健康。

2 魚類出血病的病因及其特點(diǎn)

魚類出血病呈全國性發(fā)生，危害程度高，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，出血病導(dǎo)致年經(jīng)濟(jì)損失超百億元，該類疾病的高發(fā)區(qū)域主要集中在我國的華南、華東、華中等地區(qū)。淡水魚和海水魚類，草食性和肉食性魚類，有鱗和無鱗魚均可發(fā)生出血病，池塘、池塘網(wǎng)箱、流水養(yǎng)殖也均可發(fā)生出血病。該類疾病高發(fā)季節(jié)一般為春末夏中和夏末秋中，發(fā)病水溫一般為25℃～35℃之間。生物性因素引發(fā)的魚類出血病占80%～90%，其中病毒性占30%～50%，細(xì)菌占30%～50%，寄生蟲占5%～10%，而非生物性因素引發(fā)的魚類出血病占10%～20%，這表明細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲性疾病占主導(dǎo)地位。

2.1 常見細(xì)菌性出血病

2.1.1 球菌類：無乳鏈球菌

羅非魚無乳鏈球菌病嚴(yán)重危害華南地區(qū)的羅非魚養(yǎng)殖，該病每年造成過億元的經(jīng)濟(jì)損失。1966年Robinson，et al.第一次報(bào)道在淡水魚金色美鳊（Notemigonus crysoleucas）中分離出B群鏈球菌（Group B Streptococcus，GBS），隨后相繼有包括羅非魚在內(nèi)的多種魚類受無乳鏈球菌感染而大量死亡的報(bào)道。GBS感染羅非魚的癥狀主要表現(xiàn)為食欲減退、脊柱移位、眼球出血（圖1-A）、角膜渾濁（圖1-B）、鰭條基部出血、腹部出血、漫游，剖解可見肛周紅腫（圖1-C），肝、腎、脾腫大，充血、出血（圖1-D），腦膜出血（圖1-G），腸漿膜出血（圖1-E），腸腔內(nèi)有黃色透明黏液，腸壁變?。▓D1-F）。其中腦部出血是GBS的特征性病變，這主要是由于GBS能通過莢膜多糖逃避宿主免疫清除，并與血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞群粘附，并穿透血腦屏障。因此，GBS于兔血平板不溶血（圖1-H）。

2.1.2 桿菌類：魯氏耶爾森氏菌

魯氏耶爾森菌是一種革蘭氏陰性棒狀細(xì)菌（圖2-C），能在淡、海水中引起鮭魚和斑點(diǎn)叉尾鮰等的耶爾森病或腸炎紅嘴?。‥RM），其特征性癥狀為嘴部周圍明顯出血。該菌宿主范圍廣，多數(shù)鮭魚都易感。該病可水平傳播，許多無癥狀帶菌魚和鳥類都可攜帶并儲(chǔ)備魯氏耶爾森菌。該病暴發(fā)往往由環(huán)境壓力介導(dǎo)，例如水質(zhì)變差、水溫升高、魚群分池處理等情況中。在最急性感染中，由于粘膜下層充血而導(dǎo)致口腔和下頜呈現(xiàn)充血的病變，這種病變并不是所有患病魚都會(huì)出現(xiàn)，但該病卻因該癥狀而得名為腸炎紅嘴病（圖2-A）。解剖病變往往有腸道充血、出血，漿膜有瘀點(diǎn)，脾腎腫大（圖2-B），而在感染了魯氏耶爾森菌的斑點(diǎn)叉尾鮰中還會(huì)在腹膜上表現(xiàn)出明顯的出血癥狀（圖2-F）。組織病變中，可見出血、充血、水腫，一些組織中（鰓和腦中出現(xiàn)細(xì)菌的頻率較高）可見定植的細(xì)菌。在腎臟腎小球和脾臟中?？梢娨蚣?xì)菌定植而引起的壞死（圖2-D，E）。

圖1 無乳鏈球菌感

圖2 魯氏耶爾森感

2.1.3 嗜水氣單胞菌

嗜水氣單胞菌分布十分廣泛是氣單胞菌敗血癥的病原。在上個(gè)世紀(jì)70年代嗜水氣單胞菌對(duì)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類的影響非常大，直到80年代開始應(yīng)用疫苗后情況才有所好轉(zhuǎn)，近期研究發(fā)現(xiàn)鱘魚對(duì)該菌易感性較強(qiáng)，其發(fā)生急性感染時(shí)，其發(fā)病率和死亡率都在90%以上?；疾△\體表多處潰瘍?cè)睿▓D3-A），嘴部周圍充血、出血（圖3-B），性腺、鰾膜出血（圖3-C），肝臟腫大（圖3-D），腹腔內(nèi)出現(xiàn)含血腹水（圖3-E），組織病理學(xué)觀察可見病鱘肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的空泡變性（圖3-F），腎間質(zhì)炎性水腫（圖3-G），間質(zhì)細(xì)胞壞死（圖3-G），脾組織出血（圖3-H），同時(shí)，免疫組化可見病鱘魚脾臟、肌肉、腎臟等（圖3-I，3-J，3-K）組織出現(xiàn)嗜水氣單胞菌的陽性信號(hào)。

2.2 病毒性出血病發(fā)病機(jī)理

2.2.1 呼腸孤病毒：草魚出血病

早在20世紀(jì)50年代，倪達(dá)書發(fā)現(xiàn)草魚會(huì)發(fā)生出血這樣的病癥，隨后以中科院水生生物研究所為代表的科研人員展開一系列草魚出血病病原學(xué)研究，1983年陳燕燊和江育林將草魚出血病的病原命名為草魚呼腸孤病毒（Reovirus of grass carp），又稱草魚出血病病毒（Grass Carp Haemorrhage Virus，GCHV）。GCRV不僅能在草魚自身體內(nèi)繁殖，而且具有遺傳性，它能夠在草魚體內(nèi)產(chǎn)生合胞體狀細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。此病毒可在GCO、GCK、CIK、ZC-7901、PSF以及GCF等草魚細(xì)胞株內(nèi)增殖。一般情況下，草魚在此溫度環(huán)境下感染病毒12 h以后病毒就開始復(fù)制，24～27 h以后病毒開始大量繁殖，侵害機(jī)體細(xì)胞。

草魚感染GCRV后，各臟器小血管內(nèi)皮受損嚴(yán)重，引起彌散性血管內(nèi)凝血并形成微血栓，導(dǎo)致循環(huán)血量減少，正常代謝功能障礙，最終導(dǎo)致臟器組織病變。草魚出血病的發(fā)病季節(jié)長、流行范圍廣，每年6月中下旬至9月底是主要流行季節(jié)，流行高峰一般出現(xiàn)在7月和9月，死亡率高。高密度飼養(yǎng)的魚種池危害更甚，常造成全池魚死亡。按病魚的癥狀，草魚出血病大致可分為紅鰭紅鰓蓋型、紅肌肉型、腸炎型三種類型，紅鰭紅鰓蓋型病魚體色發(fā)黑，口腔、上下頜、頭頂部、眼眶周圍、鰓蓋有出血點(diǎn)（圖4-D，4-E）。紅肌肉型病魚外表出血不明顯，但剝?nèi)ケ砥た梢娂∪獬尸F(xiàn)點(diǎn)狀出血，甚至全身肌肉出血呈鮮紅色（圖4-F）。腸炎型則表現(xiàn)腸壁充血或出血，腸壁彈性較好，腸內(nèi)無食物，黏液少，應(yīng)注意與細(xì)菌性腸炎區(qū)分（圖4-G）。組織病變可見骨骼肌纖維水腫、壞死，紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤（圖4-H）；肝靜脈上皮變性，和周圍組織分離，胞漿內(nèi)可見嗜酸性包涵體（圖4-I）；腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡化、壞死, 官腔中有紅細(xì)胞（圖4-J）。

2.2.2 皰疹病毒：鯽魚鰓出血

鯉科魚類皰疹病毒病包括錦鯉皰疹病毒病、皰疹病毒性造血器官壞死病、鯉痘瘡病，主要危害鯉科魚類，且均會(huì)在魚體表面產(chǎn)生皰疹樣病變。其中，鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）又稱皰疹病毒性造血器官壞死病病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus，HVHNV），能引起的金魚和鯽魚的一種高致病性疾病，會(huì)對(duì)脾、腎等造血器官產(chǎn)生嚴(yán)重破壞，體表嚴(yán)重出血，死亡率高達(dá)80%～100 %，成世界范圍流行，在我國，除有報(bào)道江蘇異育銀鯽感染CyHV-2外，其它地區(qū)還未有大規(guī)模暴發(fā)CyHV-2的文獻(xiàn)記錄。最早發(fā)現(xiàn)鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）的宿主是金魚，1992年秋日本西部養(yǎng)殖場(chǎng)最早發(fā)現(xiàn)金魚感染CyHV-2并引起大規(guī)模死亡，死亡率最高達(dá)到100 %。隨后，1995年臺(tái)灣地區(qū)金魚苗亦發(fā)生CyHV-2感染，通過電子顯微鏡檢測(cè)到皰疹病毒顆粒。1997年春季美國西岸地區(qū)金魚苗種突發(fā)CyHV-2感染并引起死亡，后該病在美國大面積流行，死亡率超過80%。觀賞魚的國際貿(mào)易可能已經(jīng)導(dǎo)致該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛分布。2002～2004年英國、澳大利亞、新西蘭也有金魚感染CyHV-2報(bào)道。鯽魚作為金魚的同種祖先是中國內(nèi)陸地區(qū)主要食用淡水魚之一。近年來，歐洲的匈牙利、捷克等國相繼發(fā)現(xiàn)野生銀鯽被CyHV-2感染并發(fā)生嚴(yán)重病害。這是除金魚外CyHV-2感染鯽魚并引起爆發(fā)流行病害的最早報(bào)道。幾乎與歐洲病害發(fā)生同時(shí)我國華東地區(qū)陸續(xù)發(fā)生了異育銀鯽“鰓出血”病，并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，其病原最終也被證實(shí)為CyHV-2。鯽魚鰓出血病會(huì)出現(xiàn)全身出血癥狀，尤以鰓部出血最為嚴(yán)重（圖5-A，5-B），同時(shí)，通過免疫熒光技術(shù)能在自然發(fā)病鯽魚鰓（圖5-C，5-D）、肝（圖5-E，5-F）、脾（圖5-G，5-H）、腎（圖5-I，5-J）等組織中觀察病毒分布。

圖3 嗜水氣單胞菌感

圖4 草魚患呼腸孤病毒感

3 魚類出血病防控關(guān)鍵技術(shù)

3.1 診斷技術(shù)

3.1.1 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)是利用抗原和抗體之間的特異性反應(yīng)，檢測(cè)病原微生物。目前，用于魚類疾病診斷的免疫學(xué)技術(shù)主要有單克隆抗體技術(shù)、凝集反應(yīng)技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、酶免疫技術(shù)、膠體金技術(shù)等。其中，單克隆抗體技術(shù)是利用單抗的特異性、均一性、高效性來進(jìn)行疾病的診斷，該技術(shù)具有快速、簡單、靈敏度高的特點(diǎn)，但單克隆抗體的制備方法還有待改進(jìn)。2013年，連科迅等制備了抗傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）單克隆抗體6G7，該抗體效價(jià)高、靈敏度高，特異性強(qiáng)，與天然抗原親和力強(qiáng)，可用于傳染性造血器官壞死病毒的快速診斷。另外，熒光抗體技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，敏感度高，但對(duì)儀器設(shè)備要求過高。鄢慶枇等在2006年應(yīng)用熒光抗體技術(shù)檢測(cè)牙鲆體內(nèi)的弧菌。酶免疫技術(shù)的方法很多，用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病診斷的主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）技術(shù)和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）技術(shù)。該方法具有操作簡便，靈敏度高，可定量的優(yōu)點(diǎn)。膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。運(yùn)用較多的是膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）和快速斑點(diǎn)免疫金滲濾技術(shù)（DIGFA）。孟小林等在2007年用免疫膠體金結(jié)合免疫層析法研制了一種快速檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）的試劑條。

3.1.2 分子生物學(xué)技術(shù)

魚類疾病診斷的分子生物學(xué)技術(shù)有核酸雜交技術(shù)、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)、LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）技術(shù)、限制性酶酶切檢測(cè)技術(shù)、16S rRNA檢測(cè)技術(shù)和基因芯片技術(shù)。

PCR技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行魚病診斷的常規(guī)技術(shù)和主流技術(shù)，用于疾病診斷及其衍生來的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、套式PCR、多重PCR等。而LAMP技術(shù)是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)速度快、操作簡單，產(chǎn)物檢測(cè)方便。張金鳳等在2013年建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)草魚出血病病毒的方法，最低檢測(cè)限為33pg，比PCR方法靈敏度高10倍?；蛐酒夹g(shù)是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。國內(nèi)外都還處于起步階段，僅用于診斷一些主要的細(xì)菌病和病毒病。

3.2 對(duì)癥治療措施

3.2.1 化學(xué)藥物

雖然人們逐漸發(fā)現(xiàn)抗生素治療非病毒性疾病會(huì)伴隨環(huán)境污染、耐藥性等副作用，并且隨著科技的進(jìn)步，出現(xiàn)了越來越多的非病毒性疾病治療手段，并且終有一天會(huì)將其取代。但不可否認(rèn)，目前抗生素療法仍然是對(duì)抗非病毒性疾病，尤其是細(xì)菌病最有效的方法。當(dāng)爆發(fā)細(xì)菌性出血病時(shí)，應(yīng)在病原分離鑒定和藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在專業(yè)人員的指導(dǎo)下，合理、合法地使用抗生素。對(duì)于寄生蟲性病原，可在合理使用敵百蟲或其它類殺蟲藥進(jìn)行驅(qū)蟲。

3.2.2 中草藥

某些中草藥具有收斂、凝固、清營、涼血等作用，可作為止血藥用于內(nèi)因性及創(chuàng)傷性出血。如大薊、山茶花等。仙鶴草、藕節(jié)、山捻子、蓮房。黃芪、板藍(lán)根等具有抗病毒和提升機(jī)體免疫力的功效，已在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治實(shí)踐中上較多應(yīng)用。

3.3 免疫學(xué)方法

就目前看來，對(duì)于控制病毒和細(xì)菌等微生物病原引起的常伴有出血的傳染病最有效、最有用和最生態(tài)的方法仍然還是免疫學(xué)的方法。這個(gè)方法包括主動(dòng)免疫學(xué)和被動(dòng)免疫學(xué)技術(shù)，前者主要是利用疫苗作為抗原接種魚體，讓其體內(nèi)自行產(chǎn)生能特異性消滅該抗原病原的抗體，后者是直接制成特異性的抗體對(duì)魚體注射或口服，讓其進(jìn)入體內(nèi)就直接抵抗和滅活病原微生物。尤其是對(duì)于病毒性疾病，當(dāng)前還沒有很有效的治療方法的情況下，免疫學(xué)技術(shù)還是最重要的防控方法。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展疫苗制作又可分為傳統(tǒng)疫苗和現(xiàn)代生物技術(shù)疫苗。在水生動(dòng)物疾病免疫上，傳統(tǒng)疫苗仍然是當(dāng)前使用最多最可靠的疫苗，可分為兩個(gè)主要類型：弱毒疫苗和滅活疫苗，目前國內(nèi)已有草魚出血病弱毒疫苗和滅活疫苗及嗜水氣單胞菌滅活疫苗上市。生物技術(shù)疫苗重組DNA技術(shù)為疫苗學(xué)開創(chuàng)了一個(gè)全新的領(lǐng)域，重組DNA技術(shù)可用于識(shí)別和分離抗原，通過克隆和表達(dá)病原微生物中部分或全部的抗原，在國外已有皰疹病毒等一批這方面的疫苗面市，國內(nèi)已有多種這方面疫苗正在研發(fā)中，有的已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。DNA疫苗的概念是在20世紀(jì)90年代初提出的。質(zhì)粒DNA可以在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞目前一些單位正在研發(fā)鮭鱒魚傳染性造血組織壞死病的DNA疫苗，并取得了良好的效果。

被動(dòng)免疫是指將抗體從一個(gè)機(jī)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)機(jī)體所導(dǎo)致的免疫過程，被動(dòng)免疫雖不能誘導(dǎo)長期保護(hù)，但在病魚不能及時(shí)產(chǎn)生抗體或由于免疫缺陷不能產(chǎn)生抗體的情況下十分有用。卵黃抗體（Immunoglobulin of egg yolk,IgY）是一種存在于禽類，兩棲類和爬行類血清中的主要免疫球蛋白，其中以禽類IgY的研究最多。在水產(chǎn)上，由于禽類和魚類在進(jìn)化距離上較遠(yuǎn)，具有較高的抗魚類抗原活性，魚類抗原易于刺激禽類的免疫應(yīng)答，并從禽類卵黃中獲得大量多克隆抗體。加上禽類IgY不能識(shí)別魚體內(nèi)的補(bǔ)體，同時(shí)由于禽類與魚類有著明顯的生物學(xué)差異，禽類病原體往往對(duì)魚類無致病性，應(yīng)用相應(yīng)的禽類IgY抵抗魚類病原具有很明顯的效果。（參考文獻(xiàn)略）