付　歐，張　娟，堵國成，陳　堅

（1．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3．江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；4．江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；5．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

可降解大豆過敏原蛋白酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)

付歐1，4，5，張娟1，5，堵國成2，5，陳堅*3，5

（1．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3．江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；4．江南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；5．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

將前期篩選獲得的芽孢桿菌Bacillus sp.BBE201108發(fā)酵培養(yǎng)后，以其發(fā)酵上清液作為蛋白酶的粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、透析除鹽、Q FF陰離子交換層析和Superdex 75凝膠過濾層析，蛋白酶的比酶活達(dá)到2 575.45 U/mg，純化倍數(shù)為10.55，回收率為6.48%，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶，該蛋白酶的表觀相對分子質(zhì)量約為46 000。該酶與大豆分離蛋白在pH 8.0，50℃下反應(yīng)30min，可有效降解β-伴大豆球蛋白的α亞基和α'亞基。在pH 7.0～9.0以及30～40℃下的穩(wěn)定較好；Ca2+存在的情況下，酶活提高了5%左右，而Mn2+、Fe2+和Cu2+在不同程度上對該蛋白酶有抑制作用；苯甲基磺酰氟（PMSF）對該蛋白酶的抑制作用較為顯著。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，該蛋白酶的Km為4.19 g/L，Vmax為4.04 g/（L·s），Kcat為107.73 s-1，Kcat/Km為25.71 L/（g·s）。關(guān)鍵詞：大豆過敏原；芽孢桿菌；蛋白酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

大豆具有豐富的必需氨基酸組分，是人和畜禽的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白源，具有很高的營養(yǎng)價值，此外，大豆蛋白還具有優(yōu)越的加工性能如乳化性和起泡性等［1］，以及良好的生理功能，能降低膽固醇、減少患心臟疾病的危險等［2-4］。隨著大豆蛋白分離技術(shù)的改進(jìn)，大豆蛋白作為營養(yǎng)性和功能性成分得到了廣泛的應(yīng)用，以大豆蛋白為基礎(chǔ)的加工食品是目前食品工業(yè)中增長最快的一類［5］。但是，大豆蛋白也是主要致敏原之一，全球有近0.3%-0.4%的人口對大豆過敏［6］。研究發(fā)現(xiàn)，約有0.3%-0.4%的嬰幼兒會對大豆蛋白過敏，而且隨著大豆蛋白制品被廣泛使用，成人對大豆蛋白過敏的發(fā)病率也在不斷地攀升［7］。大豆過敏癥狀表現(xiàn)出多種不同形式，常見的包括濕疹、過敏性皮炎和哮喘等［8-9］。此外，大豆蛋白作為動物飼料的主要蛋白源，其致敏成分會損傷動物腸道，不利于動物的生長［10-12］。

大豆蛋白分為15S球蛋白、11S球蛋白、7S球蛋白和2S球蛋白，其中11S球蛋白和7S球蛋白約占大豆蛋白總質(zhì)量的70%［13］。β-伴大豆球蛋白是7S組分的主要成分，由 α'（76×103），α（72×103）和 β （53×103）亞基組成的相對分子質(zhì)量為1.50×105的三聚體化合物，約占大豆蛋白總質(zhì)量的20%～30%［14］。Ogawa等按照致敏能力和蛋白含量，把Glym Bd 60K、Glym Bd 30K和Glym Bd 28K作為主要大豆致敏原［15］。Glym Bd 60K即β-伴大豆球蛋白的α亞基，是一種糖蛋白，可被25%左右的大豆敏感患者的血清識別［16］。Krishnan等發(fā)現(xiàn)Glym Bd 60K、α'亞基和β亞基都是能引發(fā)大豆過敏反應(yīng)的潛在致敏原。引起過敏反應(yīng)的過敏原閾值水平通常很低，很少量的致敏原就足以引發(fā)過敏反應(yīng)［17-20］。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)開展了部分關(guān)于消除Glym Bd 60K或β-伴大豆球蛋白的研究。Tsumura等發(fā)現(xiàn)Proleather FG-F堿性蛋白酶能夠降解致敏蛋白β-伴球蛋白α亞基、Gly m Bd 30K及Gly m Bd 28K［21］。賈振寶選擇外源蛋白酶（木瓜蛋白酶、Alcalase、Nutrase和AS1.398）對大豆蛋白進(jìn)行水解處理，以完全降解7S球蛋白［22］。由于當(dāng)前所嘗試的商品酶在對大豆蛋白進(jìn)行脫敏時，不能專一性地識別過敏原，因此會在脫敏的同時降解大豆非過敏原成分的其他蛋白，而大豆蛋白往往因在該過程中被降解得過于徹底而破壞其加工性能。目前，尚未尋找到專一性的酶對β-伴大豆球蛋白α亞基和α'亞基進(jìn)行有效降解，也缺乏對大豆蛋白有特異性脫敏效果的酶的進(jìn)一步探索。

在前期研究中，作者通過篩選獲得了一株可有效降解大豆蛋白過敏原的野生菌 Bacillus sp. BBE201108。該野生菌發(fā)酵上清液與大豆分離蛋白在50℃下反應(yīng)10 min，可特異性降解β-伴大豆球蛋白α亞基，當(dāng)反應(yīng)時間延長至2 h時，β-伴大豆球蛋白α'亞基也被完全降解［23］。在上述研究的基礎(chǔ)上，對該菌株所產(chǎn)的蛋白酶進(jìn)行了分離純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，從而為深入認(rèn)識該蛋白酶的特性，并進(jìn)一步將其應(yīng)用于特異性高效降解大豆過敏原的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器酪蛋白和福林酚購自上海生工生物工程公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自碧云天生物技術(shù)研究所；酵母粉和蛋白胨購自O(shè)xoid公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PXXDHS-40X50-S恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；5804R臺式高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司；蛋白電泳儀和GelDoc凝膠成像儀購自Bio-Rad公司；AKTA pure層析系統(tǒng)、Q FF 1mL和Superdex G 75均購自GE Health公司。

1.1.2菌株芽孢桿菌Bacillus sp.BBE201108為實驗室保存。

1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件：參考朱婷等的文獻(xiàn)操作［23］。

1.3制備大豆分離蛋白

大豆分離蛋白（SPI）參考Pandjaitan的方法進(jìn)行制備并稍加改動［24］。將100 g大豆粉碎成粉，加入500 mL正己烷充分?jǐn)嚢杌靹蛱崛? h，于4℃，10 000 r/min離心10 min后去除上清液，在通風(fēng)櫥中揮發(fā)完全去除多余正己烷，得到脫脂豆粉。按照1∶10的比例向脫脂豆粉中加入去離子水，充分震蕩攪拌提取2 h，于4℃，10 000 r/min離心10 min后取上清，用HCl將上清液調(diào)至pH 4.5，靜置1 h，于4℃，10 000 r/min離心10min后去除上清，用少量的去離子水溶解沉淀，再用NaOH溶液將其調(diào)至pH 7.0，靜置1 h，冷凍干燥后得到大豆分離蛋白（SPI）以備用。

1.4酶解大豆分離蛋白

從菌株Bacillus sp.BBE201108中分離得到的酶與大豆分離蛋白溶液進(jìn)行反應(yīng)30 min，反應(yīng)條件為pH 8.0，50℃。通過SDS-PAGE判斷其是否能夠降解大豆分離蛋白過敏原的β-伴大豆球蛋白的α亞基（Glym Bd 60K）和α'亞基。

1.5酶活測定

以2 g/dL酪蛋白溶液為底物，利用福林酚法［25］測定蛋白酶的活力。酶活力定義為：1 mL酶液在pH 8.0，50℃下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位，U/mL。利用酪氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6蛋白濃度測定

按照Bradford法對蛋白濃度進(jìn)行測定［26］，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7蛋白酶的分離純化

所有的純化步驟都在4℃下進(jìn)行。

1.7.1粗酶液的制備發(fā)酵液于4℃，10 000 r/min離心10 min后得到發(fā)酵上清液，即為粗酶液。

1.7.2硫酸銨分級沉淀向粗酶液中一邊攪拌一邊緩慢加入硫酸銨粉末飽和度達(dá)到50%，靜置2 h后，于10 000 r/min離心10 min，取上清液，繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨粉末至飽和度為80%，靜置2 h后，于10 000 r/min離心10min，取沉淀。將沉淀溶解于50 mmol/L，pH 9.0的Tris-HCl溶液中，然后透析除鹽，得到初步純化的酶液。

1.7.3陰離子交換層析將上述得到的酶液上Q FF柱進(jìn)行陰離子交換層析。用0～1 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH 9.0），以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，紫外檢測器檢測波長280 nm的吸收值，收集洗脫階段的酶活組分并測定其蛋白濃度，得到中度純化的酶液。

1.7.4凝膠過濾層析將陰離子交換層析所得的酶液經(jīng)濃縮后，上樣到Superdex 75 10/300 GL凝膠柱（已用25mmol/L，pH 8.0的磷酸鈉緩沖液平衡），用平衡液以0.8 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，紫外檢測器檢測波長280 nm的吸收值，收集洗脫階段的酶活組分并測定其蛋白濃度，得到最終純化的純酶。

1.8純化得到的蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.8.1酶的最適反應(yīng)pH和溫度純化后的蛋白酶分別在pH 6.0～10.0不同緩沖液體系下于50℃測定酶活，最高酶活者設(shè)為100%。實驗所用緩沖液：pH 6.0～8.0，磷酸鈉緩沖液；pH 9.0`10.0，Gly-NaOH緩沖液。在最適反應(yīng)pH的條件下，于30～70℃不同溫度下測定蛋白酶酶活，酶活力最高者設(shè)為100%。

1.8.2酶的pH和溫度穩(wěn)定性將純酶液置于25 mmol/L，pH 6.0～10.0不同緩沖液中，于25℃下保溫0～60min，每10min取樣，在最適反應(yīng)溫度和pH下測定其剩余酶活力。未保溫直接測定酶液，所測得的酶活設(shè)為100%。實驗所用緩沖液：pH 6.0`8.0，磷酸鈉緩沖液；pH 9.0～10.0，Gly-NaOH緩沖液。將純酶液置于pH 8.0（25mmol/L，磷酸鈉緩沖液）分別于30，4℃，50，60℃下保溫0～60 min，每隔10 min取樣，在最適反應(yīng)溫度和pH下測定其剩余酶活。未保溫直接測定酶液，所測得的酶活設(shè)為100%。

1.8.3金屬離子對酶活力的影響分別向酶液中添加Mn2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、K+和Li+，終濃度達(dá)到0，1，5，10 mmol/L，于pH 8.0，25℃下保溫60 min，測定其剩余酶活。未添加任何金屬離子樣品的酶活為100%。

1.8.4酶抑制劑對酶活力的影響分別向酶液中添加苯甲基磺酰氟 （PMSF）、EDTA、碘乙酰胺（Iodoacetamide）和二硫代二硝基苯甲酸（DNTB），達(dá)到 0，1，5，10 mmol/L，于 pH 8.0，25℃下保溫 60 min，測定其剩余酶活。未添加任何酶抑制劑樣品的酶活為100%。

1.8.5酶動力學(xué)參數(shù)測定純化后的酶液在最適反應(yīng)溫度和pH條件下，以不同濃度的酪蛋白溶液為底物，測定產(chǎn)物酪氨酸的產(chǎn)量，計算相應(yīng)的反應(yīng)速度，用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）作圖，求得Km和Vmax。再根據(jù)酶濃度計算Kcat值，算出Kcat/ Km值。

2　結(jié)果

2.1蛋白酶的分離純化

蛋白酶在硫酸銨飽和度50%～80%下沉淀，充分透析除鹽后，蛋白酶有較高的比酶活569.27 U/ mg，發(fā)酵上清液的比酶活244.20 U/mg，在硫酸銨飽和度50%～80%時有較好的濃縮效果。上述得到的酶液經(jīng)Q FF陰離子交換層析，在0.1～0.3 mol/L NaCl處的洗脫峰檢測到蛋白酶酶活，而在其他的洗脫峰中未檢測到蛋白酶酶活（圖1）。經(jīng)過超濾離心管濃縮后，再經(jīng)Superdex 75 10/300 GL凝膠過濾層析，蛋白酶被進(jìn)一步純化洗脫下來（圖2）。經(jīng)一系列的純化后，該蛋白酶的純化倍數(shù)為10.55倍，回收率為6.48%，分離純化結(jié)果見表1。

圖1　蛋白酶Q FF層析純化圖譜Fig.1　Purification　of protease　by　Q　FF　column chromatography

圖2　蛋白酶Superdex 75層析純化圖譜Fig.2　Purification of protease by Superdex 75 column chromatography

表1　蛋白酶的純化Table 1　Purification of protease

2.2SDS-PAGE驗證

利用SDS-PGAE檢驗最終純化所得蛋白純度，圖3（a）顯示，該樣品得到單一條帶，說明該酶純化達(dá)到電泳純。結(jié)合凝膠過濾層析圖譜以及SDSPAGE結(jié)果分析，推測該蛋白酶的相對分子質(zhì)量大小約為4.6×104。將得到的純酶與大豆分離蛋白（SPI）反應(yīng)后，利用SDS-PAGE檢驗其降解大豆過敏原的能力，如圖3（b）所示，所獲得的純酶能夠水解大豆過敏原的β-伴大豆球蛋白α亞基（Glym Bd 60K）和α'亞基。

圖3　純化后的蛋白酶及其與大豆分離蛋白的反應(yīng)液的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3　SDS-PAGE of protease and desensitized SPI

2.3酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1酶的最適反應(yīng)pH和溫度酶的最適反應(yīng)pH實驗結(jié)果見圖4（a），該蛋白酶在pH 8.0的緩沖體系下測定得到的酶活明顯高于pH 6.0和pH 10.0，略高于pH 7.0和pH 10.0，說明該酶的最適反應(yīng)pH值為8.0。酶的最適反應(yīng)溫度結(jié)果如圖4（b）所示，該蛋白酶在50℃下測得酶活顯著高于在30，40，60，70℃下的酶活，表明該蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。

圖4　蛋白酶的最適反應(yīng)pH值和溫度Fig.4　Effects of pH and temperature on protease activity

2.3.2pH和溫度的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性研究顯示（圖5（a）），該純酶在pH 7.0～9.0的范圍內(nèi)于25℃保溫60min后，仍能維持80%以上的酶活力。溫度穩(wěn)定性實驗結(jié)果（圖5（b））顯示，該純酶于30～40℃保溫60 min，穩(wěn)定性較好，酶活力仍能夠維持80%以上；于50℃保溫10 min后，剩余酶活力為77%，保溫60 min后降至8%；在60℃保溫40 min后，酶活力完全喪失。

2.3.3金屬離子對酶活力的影響不同金屬離子對酶活力的影響如圖6所示。Ca2+對酶活力有著一定的激活作用，Ca2+濃度在1，5，10mmol/L時，酶活力分別升高到105.32%，104.66%和104.66%。Mg2+、 Zn2+、K+和Li+對酶活力的影響不大，而研究中所選擇的其它試劑對酶活力均有不同程度的抑制作用。其中Mn2+和Fe2+以及高濃度（10 mmol/L）的Cu2+對酶活的抑制作用最為顯著。隨著Fe2+、Mn2+和Cu2+濃度的升高，酶活力均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢。當(dāng)Fe2+濃度增至5 mmol/L，Mn2+和Cu2+濃度增至10 mmol/L時，剩余酶活力均不足初始酶活的50%。

圖5　蛋白酶的pH和溫度穩(wěn)定性Fig.5　Effects of pH and temperature on protease activity stability

圖6　金屬離子對蛋白酶活力的影響Fig.6　Effectsof variousmetal ionson the protease activity

2.3.4酶抑制劑對酶活力的影響PMSF可抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶；DNTB抑制巰基蛋白酶；EDTA抑制以金屬離子為活性中心的酶。由圖7可知，PMSF對該純酶的抑制作用最為明顯，在1，5，10 mmol/L的濃度下，酶活力為初始酶活的18.68%、16.46%和13.02%，EDTA對該酶的抑制作用也較明顯。據(jù)此推測該酶為絲氨酸金屬蛋白酶。2.3.5酶動力學(xué)參數(shù)的測定測定不同［S］所對應(yīng)的v，以1/v對1/［S］繪制得到雙倒數(shù)曲線如圖8所示，經(jīng)米氏方程計算得到Km為4.19 g/L，Vmax為4.04 g/（L·s），再換算出Kcat為107.73 s-1，Kcat/Km為25.71 L/（g·s）。

圖7　酶抑制劑對蛋白酶活力的影響Fig.7　Effects of inhibitors on the protease activity

3　結(jié)語

將Bacillus sp.BBE201108發(fā)酵液中的蛋白酶，經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、Q FF陰離子交換層析和Superdex 75凝膠過濾層析這3個階段的純化，最終純化倍數(shù)達(dá)到10.55倍，比酶活達(dá)到2 474.45 U/ mg。純化得到的蛋白酶，SDS-PAGE電泳顯示，其相對相對分子質(zhì)量約4.6×104，并且能夠有效降解大豆蛋白過敏原β-伴大豆球蛋白的α亞基和α'亞基。這一系列的純化方法達(dá)到了較好的純化結(jié)果。

圖8　該蛋白酶的Lineweaver-Burk關(guān)系Fig.8　Lineweaver-Burk plot of protease kinetics

將純化后的蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白酶在pH 7.0～9.0以及30～40℃下的穩(wěn)定較好；有Ca2+存在的情況下，酶活提高了5%左右。PMSF對該蛋白酶有著顯著地抑制作用而DNTB對該蛋白酶幾乎沒有影響，在Ca2+存在的情況下，酶活有所提高，推測該酶為絲氨酸金屬蛋白酶，可被Ca2+激活；該蛋白酶的Km=4.19 g/L，Vmax=4.04 g/（L·s），Kcat為107.73 s-1，Kcat/Km為25.71 L/（g·s）。上述研究表明，該蛋白酶適用于非發(fā)酵大豆制品的處理及加工工藝。通過對其性質(zhì)的進(jìn)一步研究，將為在保持大豆蛋白營養(yǎng)價值的基礎(chǔ)上完善大豆蛋白脫敏工藝，開發(fā)可安全攝入的大豆全系列產(chǎn)品開辟新的有效途徑。

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Purification and Enzyme Characterization of Proteasew ith Anti-A llergic Activity of Soy Sauce

FU Ou1，4，5，ZHANG Juan1，5，DU Guocheng2，5，CHEN Jian*3，5
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Carbohydrate Chem istry and Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National EngineeringLaboratoryfor Cereal FermentationTechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.SynergeticInnovationCenter of FoodSafetyandNutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；5.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The protease isolated from Bacillus sp.BBE201108 was purified using ammonium sulfate fractionalprecipitation，dialysis，Q FFanion exchange chromatography and Superdex 75 gel filtration chromatograph after fermentation.A purified protease w ith a recovery of 6.48%had an overall purification of 10.55 fold and a specific enzyme activity of 2 575.45 U/mg.Themolecular weight was approximately 46 000 as determ ined by SDS-PAGE.Theα-subunit andα'-subunit of β-conglycinin could be effectively degraded after reactionw ith the soybean protein isolate（SPI）atpH 8.0 under 50℃for 30m in.The proteasewas relatively stable over the pH range of 7.0-9.0 at 30～40℃.The protease activity enhanced by 5%in the presence of Ca2+，and inhibited by Mn2+，F(xiàn)e2+and Cu2+.A significantnegative effectof phenylmethanesulfonyl fluoride（PMSF）was observed on the protease activity.The values of Km，Vmax，Kcatand Kcat/Kmfor the proteasewere 4.19 g/L，4.04 g/ （L·s），107.73 s-1and 25.71 L/（g·s），respectively.

soybean allergen，Bacillus sp.BBE201108，protease，purification，protease properties

O 814.1

A

1673—1689（2016）04—0350—07

2014-12-08

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAK10B03）；國家自然科學(xué)基金項目（31470160）；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃項目（IRT1135）。

陳堅（1962—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化與控制、酶技術(shù)、食品生物技術(shù)研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn