鄧 雪，何 丹，周云莉，熊華蓉，張景勍

（1.重慶醫(yī)科大學 藥學院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學 藥物高校工程研究中心/生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶400016）

尿酸酶多囊脂質體的酶學性質及其免疫原性

鄧 雪，何 丹，周云莉，熊華蓉，張景勍*

（1.重慶醫(yī)科大學 藥學院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學 藥物高校工程研究中心/生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶400016）

研究尿酸酶多囊脂質體（Uricase-multivesicular liposomes，UOMVLs）的酶學性質及其免疫原性。采用W/O/W復乳法制備UOMVLs，測定UOMVLs中尿酸酶（Uricase，UOX）的最適反應溫度、最適反應pH值、熱穩(wěn)定性以及儲存穩(wěn)定性，并以其為抗原免疫SD大鼠，制備抗血清，通過間接ELISA法檢測血清抗體效價。UOMVLs和UOX最適反應溫度均為40℃；最適反應pH值分別為8.0和8.5；UOMVLs的穩(wěn)定性明顯高于UOX；UOMVLs和UOX的血清抗體效價分別為1∶500和1∶8 000。因此 UOMVLs的酶學性質明顯優(yōu)于游離UOX，免疫原性明顯低于游離UOX，為該酶的臨床應用提供了實驗依據(jù)。

尿酸酶；多囊脂質體；酶學性質；免疫原性

尿酸酶（Uricase，UOX）催化嘌呤代謝產(chǎn)物尿酸［1］分解為過氧化氫和尿囊素，其廣泛存在于植物、真菌、細菌及某些哺乳動物的組織中，是生物體內嘌呤降解途徑中的一種重要的酶［2］。人體缺乏尿酸酶，尿酸是人體嘌呤分解代謝終產(chǎn)物。當尿酸生成增加或排泄減慢時，血中尿酸水平升高會形成高尿酸血癥，繼而引發(fā)痛風綜合征等一系列疾病［3-4］。UOX專一性強，催化效率高，是治療高尿酸血癥的候選藥物［5］。然而，UOX存在體內穩(wěn)定性差、體內循環(huán)半衰期短、生物利用度低等缺點［6］，只能通過頻繁給藥維持有效的血藥濃度從而限制了尿酸酶的大范圍的、持續(xù)的應用。

采用多囊脂質體（Multivesicular liposomes，MVLs）作為UOX的載體，以改善UOX的缺點。MVLs是采用貯庫泡沫技術的一種新型脂質體［7］，它由 Kim［8］于1983年通過改進細胞大小的單室脂質體的制備方法首先制得并命名，主要用于運輸大分子物質和親水性物質［9］。多囊脂質體具有包封率高、包封容積大、突釋少、生物相容性和生物可降解性良好等優(yōu)點［10］，可以彌補現(xiàn)有技術難以實現(xiàn)的對大分子藥物的高包封和低滲漏［11］。作者成功制備了尿酸酶多囊脂質體 （Uricase-multivesicular liposomes，UOMVLs），并對其酶學性質及免疫原性進行分析，希望克服UOX的缺點，擴大其臨床應用。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1主要材料、試劑尿酸酶、異硫氰酸熒光素購自美國Sigma公司；卵磷脂購自德國Lucas Meyer公司；三油酸甘油酯購自國藥集團化學試劑有限公司；膽固醇購自廣州天馬精細化工廠；泊洛沙姆407購自南京威爾化工有限公司；泊洛沙姆188購自德國巴斯夫公司；L-賴氨酸購自北京鼎國生物技術有限公司；含HRP的羊抗鼠工IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；牛血清白蛋白BSA購自國藥集團化學試劑有限公司；TMB（3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺）購自研域（上海）化學試劑有限公司；乙醚購自重慶川東化工集團有限公司。

1.1.2主要儀器與動物AB204S電子分析天平購自瑞士Mettler Toledo儀器公司；RE 52 AA旋轉蒸發(fā)器購自上海亞榮生化儀器廠；QL-901型旋渦混合器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-16B臺式高速離心機購自上海安亭科學儀器廠；TCS-SP2激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。清潔級SD大鼠，（230±20）g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證書為SCXK渝2012-0001。

1.2試驗方法

1.2.1UOMVLs的制備采用W/O/W復乳法制備UOMVLs［12-13］，取處方量的卵磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作為油相（O），取處方量的泊洛沙姆407、泊洛沙姆188溶于質量分數(shù)3%葡萄糖溶液中作為內水相（W1），將UOX溶于內水相。內水相與油相等體積混合后，渦旋8 min制得 W/O型初乳。將初乳快速注入到含L-賴氨酸與質量分數(shù)4%葡萄糖的外水相（W2）中，初乳與外水相的體積比為1∶3，高速分散均質機剪切制成 W/O/W型復乳，室溫下減壓旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，即得UOMVLs。

1.2.2UOMVLs的包封率的測定UOMVLs包封率的測定采用間接法［14-15］測定UOMVLs的包封率。吸取適量UOMVLs，離心5min后取上清液，加入氯仿混合均勻。取水層溶液，并用0.45μm的微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液，加入考馬斯亮藍G-250，放置2 min后在595 nm波長處測定吸收度值，計算樣品中游離UOX的濃度。另取UOMVLs，直接用氯仿破乳后同法操作取續(xù)濾液，并用所得吸收度值計算UOMVLs中的藥物總濃度。重復3次，計算包封率。包封率按下式計算：包封率（%）=（投藥質量-游離藥質量）/投藥質量×100%

1.2.3UOMVLs和UOX最適反應溫度的測定取UOMVLs和UOX樣品液，分別于20～70℃的水浴，pH8.5的硼酸緩沖液條件下測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制溫度—活性曲線圖。具體方法按照參考文獻［16］。

1.2.4UOMVLs和UOX最適反應pH值的測定取UOMVLs和游離UOX樣品液，在酶的最適反應溫度下，分別于pH 6.5～9.5的硼酸緩沖體系中測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制pH—活性曲線圖。

1.2.5UOMVLs和UOX儲存穩(wěn)定性的測定按照張敉［17］等人的方法，將UOMVLs及游離UOX放置于4℃的冰箱中，分別于第 0，1，2，4，7，10，14，20，28 d時測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制時間—活性曲線圖。

1.2.6UOMVLs和UOX熱穩(wěn)定性的測定將UOMVLs及游離UOX置于55℃的水浴中，分別于0、1、2、3、4、5 h測定UOMVLs及游離UOX的活性，繪制活性—時間曲線圖。

1.2.7UOX活性的測定UOX活性單位的定義：每分鐘催化1μmol底物尿酸轉化為產(chǎn)物所需的UOX的量。具體方法按照參考文獻［18］。在pH 8.5的硼砂緩沖液中，以75μmol/L尿酸為底物，加入20 μL濃度為0.1mg/mL的酶樣品溶液，加酶后迅速用手輕輕振搖5秒，25℃條件下反應，于0，10，20，30，40，50，60 s測定A293nm值。

1.2.8UOX與脂質膜的相互作用檢測分別取空白MVL、空白MVL與UOX的混合液及UOX樣品液各980μL，再加入20μL濃度為5.14μmol/L的異硫氰酸熒光素溶液［19］，黑暗處孵化5 min，熒光分光光度計掃描，1 mL的比色皿中檢測其熒光強度。

1.2.9UOMVLs和UOX免疫原性的檢測將SD大鼠分為4組（n=6），分別為UOMVLs組，UOX組和陽性對照組、陰性對照組。分別靜脈注射UOMVLs、UOX、卵白蛋白及生理鹽水，給藥劑量為0.5mg/kg，每周1次，連續(xù)6周。每周給藥24 h后采血，分離血清，采用間接ELISA法［20-21］測定血清抗體效價：將抗原包被用pH 9.6碳酸-重碳酸鹽緩沖液稀釋為10μg/mL，加入孔板，100μL/孔，4℃靜置過夜；棄去孔內液，洗板液洗滌3次，然后加入3%的BSA 100μL，37℃孵育1.5 h；洗滌，待測血清用質量分數(shù)0.5%的BSA稀釋100倍，待陰性對照組及陽性對照組血清加樣后37℃孵育1 h；洗滌，加入含HRP的羊抗鼠工IgG，100μL/孔；洗滌，每孔加新配制的反應液TMB反應10 min后終止反應，用酶標儀測定A450nm。最后一次免疫2周后取各組血清按照1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000稀釋后，計算各組的抗血清效價。

2　結果與討論

2.1UOMVLs的包封率

經(jīng)檢測，UOMVLs的平均包封率為 （63.75± 3.65）%。

2.2UOMVLs和U0X的最適反應溫度

測定結果顯示，UOMVLs和UOX的最適反應溫度均為40℃，見圖1。

圖1　UOMVLs和游離UOX的最適溫度（n=3）Fig.1　Optimal tem perature of UOMVLs and free UOX，（n=3）

2.3UOMVLs和U0X的的最適反應pH值

測定結果顯示，UOMVLs的最適反應pH值為8.0，UOX的最適反應pH值為8.5（見圖2）。在最適溫度下，UOMVLs的最適pH值為8.0，這種轉變可能是在制備過程中UOX的構象發(fā)生改變所致。

圖2　UOMVLs和游離UOX的最適pH（n=3）Fig.2 OptimalpH valuesofUOM VLsand free UOX（n=3）

2.4UOMVLs和UOX儲存穩(wěn)定性的測定

由圖3可知，在4℃貯存條件下中，28 h時UOMVLs中酶活性隨時間變化保持在90%以上，UOX的活性由100%下降到34.5%。說明，UOMVLs提高了酶的穩(wěn)定性。

圖3　4℃條件下UOMVLs和UOX的穩(wěn)定性（n=3）Fig.3　Stability of UOMVLs and free UOX incubated at 4℃（n=3）

2.5UOMVLs和UOX熱穩(wěn)定性的測定

圖4顯示，0～5 h內，UOMVLs在55℃水浴條件下酶活性隨時間變化保持在90%以上，游離UOX的酶活性由100%下降到39.71%。

圖4　55℃條件下UOMVLs和UOX的穩(wěn)定性（n=3）Fig.4　Stability of UOMVLs and free UOX incubated at55℃（n=3）

2.6UOX與脂質膜的相互作用

FITC與一定量游離酶結合后會有一定值的熒光強度，而當體系中的游離酶與脂質體膜結合后，與FITC結合的游離酶相應減少，使熒光強度減弱［22-23］。如圖5所示，MVLs的熒光強度最小，UOX與MVLs混合溶液的熒光強度增加，而UOX的熒光強度最大。UOMVLs較MVLs熒光強度增加，表明UOX與異硫氰酸熒光素競爭性結合脂質體膜，據(jù)此推斷，UOX與MVLs發(fā)生相互作用。

圖5　熒光圖譜Fig.5 FITC fluorescence spectra

2.7UOMVLs和UOX的免疫原性

ELISA結果顯示，UOMVLs的抗血清效價為1∶500，UOX的抗血清效價為1∶8 000，表明UOMVLs有效降低了其免疫原性。

3　結語

UOX氧化尿酸為可溶性的尿囊素，可用于痛風的臨床診斷和治療［24］。但由于蛋白質與多肽的水溶性極好，制備普通脂質體無法達到理想的包封率，藥物滲漏與突釋現(xiàn)象也使得藥物釋放不甚理想［25］。作者成功制備了UOMVLs，從包封率、最適反應溫度、最適反應pH、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、免疫原性對UOMVLs和游離UOX進行了研究，包封率達到了（63.75±3.65）%，克服了普通脂質體對UOX包封率低的缺點。

從最適溫度的實驗結果（圖1）可看出UOMVLs 和UOX的最適反應溫度均為40℃，此條件下UOMVLs的活性為UOX的213%。從最適pH的實驗結果（圖2）可看出UOMVLs和UOX的最適反應pH分別為8.0和8.5。當pH8.0時，UOMVLs的活性為UOX的160.44%；pH8.5時，UOMVLs的活性為UOX的131.00%。pH 6.5～9.5條件下，UOMVLs的活性均高UOX。

UOMVLs的穩(wěn)定性是其質量控制的關鍵因素，良好的穩(wěn)定性是大規(guī)模生產(chǎn)和應用于臨床實現(xiàn)的關鍵［26］。由圖3和圖4的結果可知，在加熱條件（55℃）和貯存條件（4℃）下，UOMVLs均能很好的保持UOX的活性，這說明UOX被MVLs包封在脂質膜內部后有更好的對抗外界溫度變化的能力。作為一種新型制劑，UOMVLs不僅提高了UOX的貯存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，實驗證明UOMVLs還有效降低了UOX的免疫原性。

因此，UOMVLs有增強UOX活性、提高UOX體外穩(wěn)定性、降低UOX免疫原性的優(yōu)點。大鼠體內靜脈注射UOMVLs和UOX的藥代動力學結果顯示，UOMVLs較UOX半衰期延長，達峰時間延后，峰濃度提高，UOMVLs的相對生物利用度約為UOX 的1 751%，UOMVLs可提高尿酸酶的生物利用度，為尿酸酶的臨床應用提供了實驗依據(jù)。

［1］張玉然，辛瑜，楊海麟，等.黃嘌呤氧化酶酶學性質及共價交聯(lián)固定化［J］.食品與生物技術學報，2014，33（1）：16-21. ZHANG Yuran，XIN Yu，YANG Hailin，et al.Enzymatic properties of xanthine oxidase and its covalent immobilization on differentsupports［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（1）：16-21.（in Chinese）

［2］TamakiH，Matsuoka T，Yasuda Y，etal.A novel laccasew ith urate oxidation activity from Lysobacter sp T-15［J］.J Biochem，2010，148（4）：481-489.

［3］Nanda P，Babu PE.Isolation，screening and production studies of producing bacteria from poultry sources［J］.Prep Biochem Biotechnol，2014，44（8）：811-821.

［4］SakaiH，Tsutamoto T，Tsutsui T，eta1.Sermn levelof uric acid，partly secreted from the failing heart is a prognosticmarker in patientsw ith congestive hean failure［J］.Circulation Journal，2006，70（1）：1006-1011.

［5］GliozziM，Malara N，MuscoliS，etal.The treatmentofhyperuricemia［J］.Int JCardiol，2015（10）：10-16.

［6］周云莉，楊林，吳建勇，等.尿酸酶復合脂質體中尿酸酶的藥動學考察［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2014，34（21）：1805-1808. ZHOU Yunli，YANG Lin，WU Jianyong，et al.Primarily study on pharmacokinetics of uricase in uricase-catalase liposome［J］. Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2014，34（21）：1805-1808.（in Chinese）

［7］VafaeiSY，Dinarvand R，EsmaeiliM，etal.Controlled-release drug delivery system based on fluocinolone acetonide-cyclodextrin inclusion complex incorporated inmultivesicular liposomes［J］.Pharm Dev Technol，2014，26：1-7.

［8］Kim S，TurkerM S，ChiEY，etal.Preparation ofmultivesicular liposomes［J］.Biochim Biophys Acta，1983，28（3）：339-348.

［9］何盛江，張現(xiàn)濤，宋力，等.曲馬多緩釋多囊泡脂質體的制備和釋放度影響因素研究［J］.海峽藥學，2014，26（2）：19-24. HEShengjiang，ZHANG Xiantao，SONG Li，etal.Studieson preparation and the factorseffecting the releasing rate of Tra-madol PEG-coatedmultivesicular liposomes［J］.Strait Pharmaceutical Journal，2014，26（2）：19-24.（in Chinese）

［10］Zuo J，Gong T，Sun X，et al.Multivesicular liposomes for the sustained release of thymopentin：stability，pharmacokinetics and pharmacodynamics［J］.Pharmazie，2012，67（6）：507-12.

［11］李晗，梅興國.多囊脂質體遞送蛋白質/多肽類藥物的研究進展［J］.中國藥學雜志，2014，49（2）：94-98. LIHan，MEIXingguo.Research progresses ofmultivesicular liposomes in delivery of protein and peptide drugs［J］.Chinese Pharmaceutical Journal，2014，49（2）：94-98.（in Chinese）

［12］Chen C，Han D，Zhang Y，etal.The freeze-thawed and freeze-dried stability of cytarabine-encapsulated multivesicular liposomes ［J］.Int J Pharm，2010，387（1-2）：147-153.

［13］Chen C，Han D，Zhang Y，etal.The freeze-thawed and freeze-dried stability of cytarabine-encapsulatedmultivesicular liposomes ［J］.Int JPharm，2010，387（1-2）：147-153.

［14］Ramprasad M P，Am ini A，Kararli T，et al.The sustained granulopoietic effect of progenipoietin encapsulated inmultivesicular liposomes［J］.Iant JPharm，2003Aug 11；261（1-2）：93-103.

［15］林愛華，劉奕明，平其能.甘草酸表面修飾阿霉素殼聚糖納米粒的制備及特性研究 ［J］.中國藥科大學學報，2007，38（6）：507-511. LINAihua，LIUYim ing，PINGQineng.Preparation and characterization of adriamycin-loaded chitosan nanoparticles surface-modifiedw ith glycyrrhizin［J］.Journal of China Pharmaceutical University，2007，38（6）：507-511.（in Chinese）

［16］周云莉，楊林，晏子俊，等.硼酸鹽緩沖液制備尿酸酶復合脂質體及尿酸酶的特性 ［J］.南方醫(yī)科大學學報，2015，35（2）：268-271. ZHOU Yunli，YANG Lin，YAN Zijun，et al.Preparation and characterization of uricase in uricase-catalase liposomes prepared using borate buffer［J］.Journal of Southern M edical University，2015，35（2）：268-271.（in Chinese）

［17］張敉，楊林，周云莉，等.脂質納米粒提高尿酸氧化酶體外穩(wěn)定性的初步研究 ［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2014，39（10）：1452-1456. ZHANG M i，YANG Lin，ZHOU Yunli，etal.Prelim inary study on the stability of urate oxidase loaded in lipid nanoparticles［J］. Journal of Chongqing M edical University，2014，39（10）：1452-1456.（in Chinese）

［18］Tan Q Y，Zhang JQ，Wang N，etal.Uricase from Bacillus fastidious loaded in alkaline enzymosomes：Enhanced biochem icaland pharmacologicalcharacteristics in hypouricemic rats［J］.Eur J Pharm Biopharm，2012，82（2012）：43-48.

［19］Fan F，Chen C C，Zhang J，et al.Fluorescence dilution technique formeasurement of album in reflection coefficient in isolated glomeruli［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2015，doi：10.1152/ajprenal.

［20］王娜，譚群友，徐美玲，等.產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶脂質體的酶學性質及其免疫原性［J］.中國生物制品學雜志，2011，24（5）：547-553. WANG Na，TAN Qunyou，XU Meiling，etal.Enzymatic property and immunogenicity of uricase liposome of candida utilis［J］. Chinese Journal of Bilogicals，2011，24（5）：547-553.（in Chinese）

［21］Pittman PR，Reisler R B，Lindsey C Y，etal.Safety and immunogenicity of ricin vaccine，RVEcTM，in a Phase 1 clinical trial［J］. Vaccine，2015，doi：10.1016/j.

［22］Tan Q Y，Wang N，Yang H，etal.Characterization，stabilization and activity of uricase loaded in lipid vesicles［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，384（2010）：165-172.

［23］Domenech O，Redondo L，Mom tero M T，et al.Specific adsorption of cytochrome C on cardiolipin-glycerophospholipid monolayersand bilayers［J］.Langmuir，2007，23（10）：5651-5656.

［24］TiwariS，Dw ivediH，Kymonil K M，etal.Urate crystal degradation for treatmentof gout：a nanoparticulate combination therapy approach［J］.Drug Deliv Transl Res，2015，5（3）：219-230.

［25］LayekB，Mukherjee B.Tamoxifencitrate encapsulatedsustainedrelease liposomes：preparationandevaluationof physicochem icalproperties［J］.Sci Pharm，2010，78（3）：507-515.

［26］戴傳云，劉火安，傅亞，等.多囊脂質體-海藻酸鈉微球的理化性質及初步穩(wěn)定性研究 ［J］.中國藥房，2008，19（28）：2203-2205. DAI Chuanyun，LIU Huoan，F(xiàn)U Ya，et al.Physicochemical property and stability of MVLs-Alg microspheres［J］.China Pharmacy，2008，19（28）：2203-2205.（in Chinese）

Enzymology and Immunogenicity of Uricase-M ultivesicular Liposomes

DENG Xue，HE Dan，ZHOU Yunli，XIONG Huarong，ZHANG Jingqing*
（1.College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Engineering Research Center in University/Chongqing Key Laboratory of Biochemical＆Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

This study aimed to investigate the enzymatic property and immunogenicity of uricase-multivesicular liposomes（UOMVLs）.UOMVLs were prepared by a double emulsion method，and optimal temperatures，pH values，storage and thermal stabilities of UOMVLs and uricase （UOX）were determ ined.SD rats were immunized using UOMVLs as antigens，and their serum antibody titerswere determ ined.Results showed that the optimal temperatures for UOMVLs and U0X were both 40℃，while the optimal pH valueswere 8.0 and 8.5，respectively.The stability of UOMVLswas significantly higher than thatof U0X.The serum antibody titers of rats immunized w ith UOMVLsand UOX were 1∶500 and 1∶8 000，respectively.Therefore，the enzymatic property of UOMVLswas significantly better and the immunogenicity was obviously lower than UOX，which provided an experimentalbasis for the clinicalapplication of UOX.

uricase，multivesicular liposome，enzymatic property，immunogenicity

Q 556；R 392-33

A

1673—1689（2016）04—0364—06

2014-11-25

國家自然科學基金項目（30973645）；重慶市首批高等學校優(yōu)秀人才資助計劃。

張景勍（1973—），女，重慶人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事藥物新劑型與新技術研究。E-mail：zjqrae01@163.com