趙 飛

(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

分析與測試

固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留

趙 飛

(遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

建立了一種同時檢測水產(chǎn)品中氯霉素(CAP)、氟甲砜霉素(FF)和甲砜霉素(TAP)殘留量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。方法以氯霉素-D5作為內(nèi)標(biāo)，采用液液萃取和固相萃取的方法分別進(jìn)行提取和純化，采用ACQUITY UPLC C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱梯度洗脫分離，用超高效液相色譜電噴霧離子源串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測，可在4 min內(nèi)完成一批次待測液的檢測。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在0.5～8 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)大于0.999。三種氯霉素類藥物的樣品檢出限均為0.1μg/kg，回收率在86.0 %～93%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%。研究結(jié)果表明，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可有效檢測水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留。

固相萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜；氯霉素類藥物；水產(chǎn)品

氯霉素類藥物是一種廣譜抗生素，它對人體的損害較大，尤其是造血系統(tǒng)，易引起再生障礙性貧血，并可導(dǎo)致致命的"灰嬰綜合征"，并能損害人們的視力，對老年人、嬰幼兒及肝腎功能不全的影響更大。甲砜霉素是將氯霉素分子中的對硝基取代為甲磺?；?，其抗菌譜同氯霉素基本相同，但因毒性降低，因此在2002年國家農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定水產(chǎn)品中魚皮和肌肉中可以檢出，限量50μg/kg。氟甲砜霉素是甲砜霉素的衍生物，它對人體造血系統(tǒng)有損害，因此氯霉素和氟甲砜霉素在水產(chǎn)品中不允許檢出。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，且是一類廣譜抗生素，因此部分水產(chǎn)養(yǎng)殖和運營企業(yè)在飼料或運輸途中添加氯霉素類藥物，以降低水產(chǎn)品在養(yǎng)殖和運輸中的疾病發(fā)生率。 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用檢測法等。三種氯霉素類藥物的分子結(jié)構(gòu)相似，在色譜柱上的保留行為也相似，單單采用液相色譜法或氣相色譜法易出現(xiàn)假陽性，而液質(zhì)聯(lián)用檢測采用多反應(yīng)離子監(jiān)測技術(shù)，通過對待測成分的母離子和子離子雙選擇，大大提高對目標(biāo)成分檢測的選擇性，同時通過比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測樣品的離子豐度比，可以進(jìn)一步對檢出成分進(jìn)行定性確證，因此本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜同時檢測水產(chǎn)品中三種氯霉素類獸藥殘留，并采用固相萃取凈化方式，實驗過程簡單、快速，準(zhǔn)確度和精密度較高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WATERS TQD超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國沃特世公司)； 渦旋混合器(德國IKA)；氮吹濃縮儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)；半自動固相萃取(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素，甲砜霉素，氟甲砜霉素，氘代氯霉素。

乙腈(色譜純，美國FISHER公司)，正己烷(色譜純，美國FISHER公司)，乙酸乙酯(色譜純，美國FISHER公司)，氨水(分析純，國藥試劑有限公司)，甲酸(色譜純，上海安譜實驗科技有限公司)，實驗用水為一級水，SPE固相萃取柱：C18(500 mg,3 CC)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

精密稱取適量氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素和氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇溶解并稀釋配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃、棕色容器中保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

以10%甲醇溶液為溶劑將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋配制為氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素濃度為0.5，1.0，2.0，4.0,8.0 ng/mL，氘代氯霉素的濃度為2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 樣品前處理

稱取均質(zhì)后的水產(chǎn)品5.0 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中。向樣品管中精密加入相當(dāng)于2ng 氘代氯霉素溶液、20 mL乙酸乙酯和1 mL氨水，于渦旋混合器上渦旋提取1 min，再向其中加入5 g無水硫酸鈉，渦旋30 s，后于5000 r/min離心10 min。精密移取上清液10 mL于另一離心管中，40 ℃下氮氣流吹至近干，用1 mL10%乙腈溶液復(fù)溶，渦旋1 min。將復(fù)溶液通過預(yù)先用10 mL甲醇、水預(yù)活化后的SPE柱，用10 mL水淋洗，60%甲醇溶液洗脫，洗脫液在氮氣流下吹至近干。向上述管中精密加入1 mL10%乙腈溶液，渦旋混合，過0.22 μm濾膜待測。

1.4 UPLC色譜條件

Waters超高效液相色譜柱：ACQUITY UPLC BEH 1.7 μ m 2.1×50 mm；流動相：乙腈(A)，水(B)，梯度洗脫程序見表1；柱溫：30 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.4 mL/min。

表1 梯度洗脫程序

1.5 MS/MS質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化；掃描方式：負(fù)離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；質(zhì)量條件參數(shù)見表2。

圖1 氯霉素類藥物及內(nèi)標(biāo)物的色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用50%甲醇溶液稀釋至200 ng/mL，以此作為質(zhì)譜條件選擇的測試液，先對各測試液進(jìn)行一級全掃描觀察總離子流圖，找到母離子；再采用選擇離子掃描，優(yōu)化錐孔電壓使待測成分盡量通過一級錐孔進(jìn)入四級桿質(zhì)量分析器，而雜質(zhì)離子不能進(jìn)入一級錐孔，選擇最優(yōu)效果的電壓作為錐孔電壓；再通過子離子掃描模式下，選擇穩(wěn)定純在且響應(yīng)較好的子離子，并通過加載不同碰撞電壓，選擇子離子響應(yīng)最好的碰撞電壓；最后編輯多反應(yīng)離子監(jiān)測方法。通過優(yōu)化碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)，使母離子和各個子離子的靈敏度達(dá)到最優(yōu)，定量分析多反應(yīng)離子監(jiān)測的最優(yōu)化參數(shù)見表2。檢測結(jié)果以保留時間和相對離子豐度比進(jìn)行定性，以響應(yīng)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量,結(jié)果見圖1。

2.1.2 液相條件的優(yōu)化

本文中檢測的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素均易溶于甲醇、乙腈等弱極性有機溶劑，且采用超高效液相色譜儀進(jìn)行樣品引入，超高效液相色譜柱分離，對于水產(chǎn)品樣品，盡管采用了前處理手段但所得待測液中還含有較多的成分，因此在設(shè)計梯度洗脫程序時，首先采用大比例的水相，意在將強極性成分先洗脫，再勻速直線調(diào)整流動相比例至大比例有機相，在此期間各組分得到較好的分離，并在分離后保持大比例有機相一段時間，各成分的分離效果達(dá)到穩(wěn)定，我們待測的三個成分會隨著有機相比例的增加過程中流入質(zhì)譜進(jìn)行檢測，同時各弱極性的成分也在此期間流出，不會殘留在色譜柱上污染色譜柱，最后將流動相比例調(diào)至初始比例進(jìn)行平衡。

2.2 線性關(guān)系和檢出限

以95%甲醇溶液作為稀釋液,將氯霉素儲備也稀釋成濃度依次為0.5，1，2，4，8 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，內(nèi)標(biāo)物濃度均為2 ng/mL，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測, 內(nèi)標(biāo)法定量，得線性方程為y=0.17x-0.035，相關(guān)系數(shù)r=0.9990，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)標(biāo)法)

稱取空白樣品5.0 g，向其中加入0.5 ng氯霉素，其余操作同樣品前處理，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，信噪比大于3，本方法樣品檢出限為0.1μg/kg。

2.3 方法精密度和準(zhǔn)確度試驗

稱取空白樣品九份，三份樣品為一組，分別添加相當(dāng)于2，6，10 ng的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作同樣品前處理方法，進(jìn)樣測試，分別計算回收率和精密度，得出回收率在86.0 %-93.0 %之間，RSD小于等于 2.0%，測定結(jié)果見表3。

表3 方法的精密度和準(zhǔn)確度試驗

3 小結(jié)

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜對水產(chǎn)品中氯霉素類獸藥殘留量的檢測方法進(jìn)行研究與開發(fā)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜檢測水產(chǎn)品中氯霉素類獸藥殘留方法，該方法操作簡單，分析速度快，試劑試藥消耗量低，抗干擾能力更強，適用于水產(chǎn)品中氯霉素類獸藥殘留的大批量檢測工作。

[1] 湯軼偉，勵建榮, 孟良玉,等.水產(chǎn)品中氯霉素藥物殘留檢測方法研究進(jìn)展 [J] .食品科學(xué), 2013,34(11)：333-337.

[2] 彭運平，齊 維，唐海波,等.應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測魚肉、蜂蜜中氯霉素的殘留量[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(12): 1415-1417.

[3] 李 卓，董文賓，李 娜,等.食品中氯霉素殘留檢測技術(shù)研究新進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技, 2010(4): 408-410.

[4] 羅文婷，吳 青，簡偉明,等.超高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中違禁獸藥氯霉素、呋喃唑酮和甲硝唑殘留[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(6): 877-880.

(本文文獻(xiàn)格式：趙 飛.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留[J].山東化工，2016，45(20)：86-89.)

Determination of Chloramphenicol Drugs in Sea Food by SPE-Ultra Performance Liquid Chromagraphy-tandem Mass Spectrometry

ZhaoFei

(Liaoning food inspection and Testing Institute,Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry( UPLC-ESI-MS/MS) method for the determination of chloramphenicol drugs in sea food was developed. Methods CAP-D5 was internal standard substance, and liquid-liquid extraction and SPE was used to extraction and purification. ACQUITY UPLC C18(50mm × 2.1mm, 1.7 μ m) chromatographic column, and gradient elution, Multiple reaction monitoring (MRM)in ESI negative mode was used for quantitation. The chloramphenicol drugs was successfully detected within 4 min. Chloramphenicol drugs had good linear relationship in the range of 0.5～8 ng/mL with the correlation coefficient larger than 0.999. The detection limit was 0.1 μg /kg, and the recovery is between 86.0%～93% with the relative standard deviation below 2.0%. A rapid, accurate and sensitivity method was developed in this study. The established method has been successfully applied to the determination of low content chloramphenicol drugs in sea food.

SPE; UPLC -MS/MS; chloramphenicol drugs; sea food

2016-08-07

趙 飛(1986—)，女，遼寧撫順人，工程師，主要從事食品理化項目的研究與開發(fā)。

O657；S948

A

1008-021X(2016)20-0086-04