俞淼，武洋，蘇昊然，程路峰

·綜述·

石墨烯及其衍生物的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

俞淼，武洋，蘇昊然，程路峰

自2004年發(fā)現(xiàn)石墨烯至今［1］，石墨烯的相關(guān)性質(zhì)開始被人們慢慢挖掘。石墨烯是由 sp2雜化連接形成的單原子層蜂窩狀二維原子晶體，是世界上最薄的新型二維納米材料，其厚度僅為 0.35 nm［2］，并擁有非常高的機(jī)械性能、表面積及電傳導(dǎo)速率，這成為石墨烯在力學(xué)、電學(xué)及光學(xué)的應(yīng)用基礎(chǔ)［3］。石墨烯應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的主要形式是功能化石墨烯，功能化石墨烯表面含有大量的活性基團(tuán)，比如羰基、羧基、羥基及環(huán)氧基等，這些基團(tuán)使石墨烯具有良好的水溶性及生物相容性［4］。

近年來，人們開始關(guān)注石墨烯在分子水平的作用。本文主要從藥物傳遞、抗菌、臨床檢測、生物工程這四個(gè)方面進(jìn)行綜述，同時(shí)對石墨烯的生物安全做了簡單介紹。雖然石墨烯的毒性較低，但是當(dāng)劑量較大時(shí)仍然有一定的毒性，如何解決石墨烯潛在的毒性及發(fā)揮好在分子水平的潛力是石墨烯未來發(fā)展的方向。

1　生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1.1傳遞載體

1.1.1抗癌藥物傳遞目前癌癥的治療手段主要為化療和放療，但是這兩種治療效果不佳且存在許多的副作用，比如惡心、嘔吐、脫發(fā)等，所以尋找新型高效、低毒的治療方法成為目前癌癥治療的焦點(diǎn)。石墨烯較大的比表面積和其衍生物表面豐富的官能團(tuán)（環(huán)氧基、羥基、羧基）與抗癌藥物結(jié)合形成的復(fù)合物通過修飾、控制顆粒的大小以及利用可透過血腦屏障等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)癌癥藥物的靶向治療，是一個(gè)很有前景的材料［5-7］。Li 等［8］利用氧化石墨烯的高近紅外吸收特點(diǎn)及高比表面積的特性，經(jīng)過修飾獲得 PEG-NGO-Pt 復(fù)合物，經(jīng)老鼠尾靜脈注射處理后，使用近紅外光在 785 nm 處照射癌癥部位 3 min 使藥物在靶點(diǎn)釋放出來，同時(shí)近紅外光照射還起到了光療的作用（圖 1）。近年來，利用石墨烯結(jié)合光療治療癌癥的研究進(jìn)展如表 1 所示，這種雙重治療不僅加強(qiáng)了藥物的治療效果，也減小了藥物的副作用。Xu 等［18］為了改善抗癌藥紫杉醇的低水溶性、生物利用度差及耐藥性等缺點(diǎn)，合成了 GO-PEG-PTX 復(fù)合物，在 MCF-7 細(xì)胞中經(jīng)紫杉醇孵育 36 h 后細(xì)胞活性為 20.3%，而經(jīng)GO-PEG-PTX 復(fù)合物孵育 72 h 后細(xì)胞活性降至 10.9%。修飾后的紫杉醇抗癌效果顯著增強(qiáng)。Tang 等［19］也利用了光敏的特性，將 Cy5.5-AS1411 配體連接到氧化石墨烯上并將制備好的納米抗癌藥物包裹其中，形成 MSN-Dox@GO-Apt復(fù)合物，通過近紅外光照射放熱使氧化石墨烯的納米層擴(kuò)張，從而實(shí)現(xiàn)門控特性，防止藥物在非靶點(diǎn)釋放。Zhou等［20］應(yīng)用配體與氧化石墨烯的特性同樣實(shí)現(xiàn)了多重靶向。將 Fe3O4納米顆粒分散在氧化石墨烯的表面和邊緣，再利用 π-π 鍵疊加將血卟啉鍵合在納米顆粒的表面，并結(jié)合光動(dòng)力學(xué)治療生成了具有細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧，進(jìn)而殺死癌細(xì)胞，這種納米復(fù)合材料針對光動(dòng)力學(xué)治療是一個(gè)很有前景的藥物傳送系統(tǒng)。石墨烯及其衍生物用于抗癌藥物的傳遞近年來研究的越來越多，這與石墨烯表面所賦予的各種性能是分不開的。從以上抗癌效果來看，相對于傳統(tǒng)的化療和放療效果已顯著提高。隨著石墨烯結(jié)合光療治療不斷被挖掘，更加完善的光療方法用于臨床已不再是夢想，但是如何進(jìn)一步提高光熱轉(zhuǎn)換效率，及納米材料在體內(nèi)的降解是探索者們所面臨的又一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

圖1　PEG-NGO-Pt 復(fù)合物結(jié)合光療治療癌癥示意圖

表1　石墨烯結(jié)合光療治療癌癥進(jìn)展

1.1.2基因傳遞基因工程在生物醫(yī)學(xué)治療方面具有很大的前景，比如核糖核酸技術(shù)、反義技術(shù)等。但由于在治療過程中易受各種酶的影響使其藥效大大降低，為了解決此類問題，人們利用納米材料如碳納米管、納米顆粒以及聚合物材料（PEI）作為基因傳遞的載體。由于它們可以和核酸連接，其中 PEI 更是基因傳遞載體的標(biāo)志，Ren 等［21］利用核酸信號肽 PKKKRKV（PV7）修飾 GO-PEI，并綁定到核酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上形成了 GO-PEI/DNA 復(fù)合物，結(jié)果與對照組相比轉(zhuǎn)運(yùn)效果明顯提高，并且發(fā)現(xiàn) PV7 促進(jìn)基因進(jìn)入細(xì)胞核。但是人們逐漸發(fā)現(xiàn) PEI 具有較高的細(xì)胞毒性及較低的生物相容性，所以開始探索新的基因傳遞載體。

近年來研究顯示，石墨烯及其衍生物具有基因傳遞的功能。Imani 等［22］利用 octaarginine-GO（R8-GO）作為一種新型納米基因傳遞載體，以 DNA 質(zhì)粒表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白為基因模型，研究了 R8-GO 進(jìn)入細(xì)胞的能力，結(jié)果表明，R8-GO 促進(jìn)了基因的分散性和生物相容性。石墨烯及其衍生物除了可以作為基因傳遞的載體外，Li 等［23］使用納米氧化石墨烯薄膜繪制成條紋，經(jīng) PEI/pDNA 復(fù)合物吸附與解吸之后接種細(xì)胞，研究結(jié)果顯示基因能夠選擇性地富集于石墨烯條紋表面，同時(shí)氧化石墨烯基底展現(xiàn)出了良好的生物相容性并實(shí)現(xiàn)了基因的緩釋（圖 2），這種用氧化石墨烯基底圖案來調(diào)節(jié)基因的傳遞用于組織工程及基因治療方向是非常重要的。利用石墨烯繪制圖案的方法除了應(yīng)用在基因傳遞，在電學(xué)、光學(xué)等方面也有報(bào)道，如用石墨烯來制作電極實(shí)現(xiàn)對 RNA 的傳遞［24-26］。石墨烯作為基因傳遞的載體比起傳統(tǒng)的脂質(zhì)體、聚合物凝膠、有機(jī)分散體等不僅保存了基因的完整結(jié)構(gòu)，而且避免了聚合、酶降解等反應(yīng)［27］。目前用于基因傳遞時(shí)氧化石墨烯用的較多，將來可以考慮開辟石墨烯其他衍生物方向，可為基因研究領(lǐng)域提供新的思路。

圖2　石墨烯條紋基底對基因的選擇性吸附

1.2抗菌

自從英國細(xì)菌學(xué)家亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素至今，抗菌藥物的發(fā)展已基本完善，但是抗菌藥也給人類帶來了眾多的挑戰(zhàn)，人類濫用抗生素導(dǎo)致耐藥性、超級細(xì)菌的產(chǎn)生，所以人類不得不從新的角度去發(fā)展抗菌類藥物，不僅要提高抗菌效果，還要減小對人類及環(huán)境的危害。近年來，人們發(fā)現(xiàn)石墨烯及其衍生物與動(dòng)物細(xì)胞具有很好的生物相容性，可以與細(xì)菌相互作用起到抗菌作用。Kurantowicz 等［28］在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同的李斯特菌和沙門菌上試驗(yàn)了石墨烯及其衍生物的抗菌性能，選用石墨烯、氧化石墨烯、還原性氧化石墨烯孵育 24 h 后，測定對細(xì)菌生長的抑制能力。結(jié)果表明在高濃度（250 μg/ml）時(shí)，細(xì)菌生長都受到了抑制，而在低濃度（25 μg/ml）時(shí)只有氧化石墨烯表現(xiàn)出抑菌能力，經(jīng)顯微成像后觀察到細(xì)菌黏附于材料的部位是不同的，細(xì)菌黏附于氧化石墨烯的表面，而黏附于石墨烯及還原性氧化石墨烯的邊緣。雖然黏附的方式不同，但是其機(jī)制是相同的。Mangadlao 等［29］報(bào)道，抗菌作用可能是由于石墨烯及其衍生物本身的化學(xué)、物理因素而導(dǎo)致，其可能的機(jī)制是石墨烯鋒利的邊緣使細(xì)菌的細(xì)胞膜受到破壞，致使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溢出而死。而另外一方面從化學(xué)因素著手，表明可能是由于生產(chǎn)過剩的活性氧（ROS）、氧化脂肪酸導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的連鎖反應(yīng)使細(xì)胞膜裂解死亡。Dallavalle 等［30］進(jìn)一步從分子機(jī)制的角度去分析，這與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及石墨烯表面親水、疏水基團(tuán)的分布是密切相關(guān)的。石墨烯及其衍生物除了自身與細(xì)菌作用之外，石墨烯家族還可以充當(dāng)抗菌藥物的載體［31-32］。

1.3臨床檢測

目前利用石墨烯及其衍生物來制造電化學(xué)傳感器和生物傳感器以提高檢測性能方面已經(jīng)有了很大的進(jìn)步。由于石墨烯內(nèi)部電子運(yùn)動(dòng)速率可達(dá)光速的 1/300，所以很大程度上縮短了檢測的反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)其穩(wěn)定的物理化學(xué)特性也可延長電極的壽命，無疑石墨烯及其衍生物是制作傳感器的絕佳材料。目前石墨烯以及電極修飾的石墨烯復(fù)合材料已被提倡用于臨床、環(huán)境等方面的檢測，其中血糖測量用的最廣泛，比起傳統(tǒng)方法提高了檢測的靈敏度［33］。Lu 等［34］利用新型氧化鎳空心球-還原性氧化石墨烯電解質(zhì)薄膜修飾的玻璃電極NiOHSs-RGO-NF/GCE 可以靈敏、選擇性地測定葡萄糖，不僅重現(xiàn)性好，而且保證了電極的長期穩(wěn)定性。石墨烯除了高速的電子傳遞外，還可以在一個(gè)廣泛的波長范圍內(nèi)發(fā)出熒光，有效淬滅其他熒光染料的熒光，可以用于制作熒光敏感傳感器，Shi 等［33］利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移聯(lián)合肽修飾的石墨烯來超敏檢測肉毒素 A 輕鏈蛋白酶活性（BoNT-LcA），BoNT-LcA 在 1 fg/ml ～ 1 pg/ml 的線性范圍內(nèi)可以很靈敏的檢測到，其檢測線為 1 fg/ml。Shi 等［35］也用相似的方法檢測了金黃色葡萄球菌的 MecA 基因序列。然而值得注意的是，由于石墨烯表面的范德華力以及較強(qiáng)的 π-π 鍵作用使石墨烯發(fā)生聚集，使其表面積減小而改變電學(xué)性質(zhì)［36］，所以如何應(yīng)用好石墨烯的優(yōu)越性質(zhì)仍然具有很大的挑戰(zhàn)。

由于石墨烯在可見光以及近紅外光范圍內(nèi)的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)，使其在生物成像方面受到了很大的關(guān)注，尤其是在活細(xì)胞內(nèi)的生物成像。目前已經(jīng)有許多關(guān)于利用石墨烯衍生物作為熒光探針在體內(nèi)和體外生物成像的嘗試。為了保護(hù)DNA 不被脫氧核糖核酸酶（DNase I）分解，Tang 等［37］將SSDNA 修飾于氧化石墨烯的表面而免于被 DNase I 水解破壞，這主要是因?yàn)榭臻g位阻效應(yīng)阻礙了 DNase I 與SSDNA 的接觸，這種保護(hù)效應(yīng)使 DNA 與其配體探針在活細(xì)胞內(nèi)分子成像方向帶來了新的希望。近年來，對于石墨烯在生物成像方面的研究逐漸偏向于石墨烯量子點(diǎn)，其穩(wěn)定的光致發(fā)光使其成為優(yōu)良的有機(jī)染料及無機(jī)量子點(diǎn)，另一方面由于自發(fā)熒光以及在短波長內(nèi)對生物樣品的光散射，可以通過選擇熒光材料在長波長范圍內(nèi)給生物樣品提供一個(gè)更深層的光透，出現(xiàn)更好的成像對比［38-39］。

1.4生物工程

鑒于石墨烯優(yōu)越的機(jī)械性能，比如高彈性、靈活性等，人們開始探索其在生物工程領(lǐng)域的作用。近年來特別是在骨組織的再生和分化方面取得了重大進(jìn)展，在骨組織工程中，石墨烯主要提供了一個(gè)三維的支架，給骨細(xì)胞提供了生長的微環(huán)境。Kumar 和 Chatterjee［40］通過還原氧化石墨烯和硝酸鍶制備 RGO-Sr，經(jīng)過進(jìn)一步修飾成為 PCL/RGO-Sr 支架，與 MC3T3-E1 成骨細(xì)胞系共同培養(yǎng)，結(jié)果與對照組相比，成骨細(xì)胞的再生和分化都顯著提高。Elkhenany 等［41］利用石墨烯作為支架促進(jìn)成年山羊間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化為成骨細(xì)胞。隨著技術(shù)的成熟，人們開始探索氧化石墨烯在其他生物工程的應(yīng)用，Yang 等［42］利用基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)老鼠的胚胎干細(xì)胞分化為多巴胺神經(jīng)元，與氧化石墨烯共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)石墨烯促進(jìn)老鼠胚胎干細(xì)胞的分化，因此結(jié)合其生物相容性、高穩(wěn)定性，氧化石墨烯有望作為多巴胺細(xì)胞移植以及再生醫(yī)學(xué)的生物材料。而石墨烯在基因工程上的應(yīng)用主要是作為DNA、RNA 的傳遞載體。石墨烯應(yīng)用于生物工程還處于初級階段，如何利用先進(jìn)的生物技術(shù)使石墨烯選擇性地黏附以及定向生長、分化是未來值得探究的。

2　生物安全

自石墨烯發(fā)現(xiàn)至今，人們利用其優(yōu)越的電學(xué)、力學(xué)、光學(xué)等性能廣泛地用于藥物傳遞、抗菌、臨床檢測以及生物工程，因此應(yīng)用于生物體內(nèi)的機(jī)會(huì)也越來越多，導(dǎo)致了無論是體內(nèi)還是體外，人類長期暴露于納米石墨烯及其衍生物的環(huán)境中，這不得不使人類開始關(guān)注其帶來的危害。有人指出對于納米材料，如果是靜脈注射，主要積累在肝臟、腎臟、脾等部位，而暴露主要積累于肺部［43］，但是無論哪種途徑都不可避免給身體帶來危害。Zhang 等［44］暴露 PC12 神經(jīng)細(xì)胞于不同粒徑的氧化石墨烯中，結(jié)果顯示乳酸脫氫酶、ROS的含量都升高從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。Vallabani 等［45］在石墨烯中培養(yǎng)人肺臟細(xì)胞，最終細(xì)胞凋亡，凋亡程度與培養(yǎng)時(shí)間及石墨烯的濃度有關(guān)。近年來，人們還發(fā)現(xiàn)石墨烯可以損傷DNA 并且使染色體畸變［46］，而石墨烯對細(xì)胞以及生物體的毒性依賴是由多方面決定的，比如尺寸大小、暴露時(shí)間、合成方法等。人類將如何控制石墨烯的毒性又是一大挑戰(zhàn)，但是也有少數(shù)人表示石墨烯與其他納米材料相比基本無毒，有人用 A549 細(xì)胞研究氧化石墨烯毒性時(shí)表示并沒有發(fā)現(xiàn)石墨烯的毒性，因?yàn)槭┎]有進(jìn)入細(xì)胞中，所以目前對石墨烯的毒性研究并沒有達(dá)成一致的意見，而對于石墨烯毒性的機(jī)制研究更是眾說紛紜，都是探究者們在將來需要攻克的問題。

3　總結(jié)與展望

石墨烯在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面雖然已經(jīng)取得了一系列進(jìn)展，但是目前還處于初級階段，所面臨的困難與挑戰(zhàn)還有很多，比如如何控制功能化石墨烯由于范德華力與 π-π 鍵的作用在生理?xiàng)l件下聚集，如何控制好功能化石墨烯的納米粒徑、形貌，如何控制好納米粒進(jìn)入生物體內(nèi)后與體內(nèi)的生物分子的吸附以及如何控制其毒性等都需要做進(jìn)一步研究。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.011

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（Y4811D405C）

830054 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（俞淼、武洋、程路峰）；100049 北京，中國科學(xué)院高能物理研究所納米材料的生物效應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（蘇昊然）

蘇昊然，Email：1558171505@qq.com；程路峰，Email：274188393@qq.com

2016-05-18