金偉，鄭長春，郭強，高春慧，祈維蓉，柏莉娟，周東東，郭雷，盧春玲，郭曉梅，王靜，柏莉欣，王剛

·技術與方法·

鏈霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的混料設計與研究

金偉，鄭長春，郭強，高春慧，祈維蓉，柏莉娟，周東東，
郭雷，盧春玲，郭曉梅，王靜，柏莉欣，王剛

鏈霉素發(fā)酵工業(yè)已經有了比較長的歷史，發(fā)展至今研究投入較大，生產水平也逐年增長，它的菌體生長和產物形成過程牽涉到一系列的生物化學反應過程［1］，包含著復雜的質量和能量傳遞，所以對其發(fā)酵過程難以進行人為控制，使得在具體生產實踐過程中主要以經驗作為依據，而理論知識方面較為匱乏。由于后來耳毒性的發(fā)現，各個國家對鏈霉素的產量和使用量開始出現明顯下降［2］，但是近年來由于化學農藥污染較為嚴重，各個國家開始研究易分解、殺菌譜廣和藥效強的生物農藥，正是由于鏈霉素的這些優(yōu)點，它逐漸開始廣泛地應用于農牧行業(yè)，并且取得了非常好的效果。鏈霉素的獲得主要是通過對灰色鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)，灰色鏈霉菌從培養(yǎng)基獲得足夠的營養(yǎng)組分和能量來合成鏈霉素，所以適宜的培養(yǎng)基成分和比例對于鏈霉素生產水平的提高至關重要?；炝显O計是一種研究配料中各組分的最佳比例的科學試驗設計方法，因子是配料中的組分或分量［3］，可以深入研究成分對響應目標值的影響，以及各個成分之間的交互作用。應用傳統的設計方法，比如單因素試驗、正交試驗等，費時費力，而且效率不高，無法精確地求取最優(yōu)值，但是應用科學先進的實驗設計方法就非常方便和高效。近幾年來風靡全球企業(yè)的六西格瑪科學管理方法，其中很重要的一部分就是試驗設計理論，尤其是在研發(fā)領域［4］的應用效果更是得到了高度的評價。六西格瑪工具中有一專門設計模塊，可以完成混料試驗設計的整個過程，并對實驗數據進行回歸分析，依據分析結果建立變量曲線方程，最后利用響應優(yōu)化器求得最優(yōu)值，能在最短的時間內利用最科學的理論方法得到所需要的目標值［5］，此種試驗設計可廣泛應用于化工、食品、醫(yī)藥和材料等各個涉及配方配比的領域。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器XHPC-3.22 型滅菌柜為山東淄博Shinva 公司產品；722N 型可見分光光度計為上海精科公司產品；SPH-3112 型雙層搖瓶機為上海世平實驗設備公司產品；L-530 型高速離心機為湘儀公司產品；PB-10 型 pH 計為德國 Sartorius 公司產品；SBA-40E 型生物傳感分析儀為山東省科學院生物研究所產品。

1.1.2菌株供試菌種灰色鏈霉菌來自山東魯抗集團鏈霉素生產車間菌種保藏室。

1.1.3試劑鏈霉素標準品（純度大于 98%）購于美國Sigma 公司；葡萄糖、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸羥胺和硫酸鐵銨均為國產分析純試劑；低溫黃豆餅粉為濟寧雙華工貿公司工業(yè)級產品；碳酸鈣為上海美宇牌工業(yè)級產品。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基組成為葡萄糖 30 g/L、低溫黃豆餅粉 25 g/L、硫酸銨 4 g/L、碳酸鈣 5 g/L、硫酸二氫鉀 0.4 g/L、氯化鈉 2 g/L。先用蒸餾水溶解無機鹽類，然后邊攪拌邊加入黃豆餅粉、碳酸鈣和葡萄糖，攪拌均勻，pH 自然，115 ℃ 滅菌 30 min。

1.2.2培養(yǎng)方法對甘油管保藏的菌株進行稀釋，將稀釋度為 10-4的菌液涂布平板，在 27 ℃，濕度 30% ～ 50% 條件下培養(yǎng) 7 d，獲得單菌落。選取豐滿、白色、梅花狀、邊緣齊整的中型單菌落孢子，在無菌條件下用接種針接種于搖瓶中，然后在 27 ℃ 的恒溫搖瓶間內振蕩培養(yǎng) 68 h，取樣進行鏈霉素含量測定，搖床轉速為 220 ～ 240 r/min，搖瓶間濕度 30% ～ 50%。

1.2.3鏈霉素的含量測定采用分光光度法，利用鏈霉素特有的麥芽酚反應［6］進行檢測。首先將發(fā)酵液進行適當的稀釋，取 15 ml 置于離心管中，加入草酸酸化，酸化至 pH = 3 左右，于水浴鍋中 75 ℃ 保溫 10 min，冷卻至室溫，于離心機中 5000 r/min 離心 20 min，準備兩支干凈的試管，分別吸取 5 ml 離心后的上清液置于試管中，向其中一支試管加入 1 滴 4% 鹽酸羥胺作為空白對照，再向兩支試管中分別加入 1 ml 氫氧化鈉溶液（2 mol/L），振蕩搖勻，于水浴鍋中 85 ℃ 保溫 15 min，冷卻至室溫，再加入 1% 硫酸鐵銨 2 ml，振蕩搖勻，靜置 10 min，在分光光度計中設定520 nm 波長下測定吸光度。以鏈霉素標準品繪制標準曲線，計算發(fā)酵液鏈霉素的效價。

1.2.4試驗設計方法以 Minitab 軟件［7］實現單純形格子設計是混料回歸設計方案中最先出現的，也是最基本的設計方案，很多其他設計方案的構成要用到單純形格子設計［8］。在（n - 1）維正規(guī)單純形（有 n 個頂點）d 階格子點集｛n，d｝中各格子點的正規(guī)單純形坐標（重心坐標）的計算中，取 n 個互相正交的單位向量，a1=（1，0，...，0），a2=（0，1，...，0），...，an=（0，0，...，1），則這 n 個單位向量的頂點便圍成一個（n - 1）維正規(guī)單純形，此正規(guī)單純形上任一點 A 都可以表示為 A = i1a1+ i2a2+... + inan=（i1，i2，...，in），其中 i1，i2，...，in≥ 0，i1+ i2+ ... + ip= 1，當 i1，i2，...，in都取分母是 d 的分數時，即

則表達式 A 所確定的總體就是（n - 1）維正規(guī)單純形的 d 階格子點集｛n，d｝，也就是說可以算出｛n，d｝中各點的單純形坐標系的坐標［9］。

本實驗設計借助 Minitab 15 六西格瑪輔助軟件工具進行混料單純形格點設計，根據魯抗鏈霉素生產車間現有培養(yǎng)基配方，碳源和氮源的配比總和范圍為 1% ～ 10%，碳源為葡萄糖，氮源為黃豆餅粉和硫酸銨，在此配方基礎上，通過混料設計進一步研究這 3 種變量的最優(yōu)配比組合，以進一步提高鏈霉素的發(fā)酵效價，增加公司盈利，所以這 3 種因子的單獨取值范圍為 1% ～ 8%，得到的設計方案如圖 1 所示，3 維度共 13 個實驗點。

圖1　單純形設計圖（按數量）

2　結果

2.1Plackett-Burman 設計法

2.1.1設計與分析利用 Minitab 軟件，按照 Minitab →Stat → DOE → Factorial design → Plackett-Burman design的順序，對黃豆餅粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈣、起始 pH 七個因素進行考察，采用試驗次數 n = 12 的設計［10］，每個因素取 -1 和 +1 兩個水平，響應值為效價（Y）。實驗設計及結果見表 1，各因素水平及主效應分析見表 2。

由表 2 分析結果可知，主效應的 F 值為 13.31，P 值為 0.012，說明主效應是顯著的，分析效果較好，再看具體的因素，t 檢驗對實驗結果產生正效應的因素為：黃豆餅粉、葡萄糖和起始 pH。產生負效應的因素為：硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和氯化鈉。在灰色鏈霉菌發(fā)酵產生鏈霉素的發(fā)酵過程中，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖三個因素對鏈霉素的效價影響較為顯著，應取這三個因素作為下一步混料設計實驗的研究對象。其他因素則根據各因素 t 檢驗效應的正負來取相應的高值或低值［11］，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值，此時效價的平均值為 2803 U/ml。

表1　Plackett-Burman 實驗設計與結果

表2　Plackett-Burman 因素水平及主效應分析

2.1.2Pareto 圖Minitab 在 Pareto 圖中顯示效應的絕對值，如圖 2，Pareto 圖使用相同的 α 作為正態(tài)圖來確定效應的顯著性大小，其中響應值為效價，α = 0.05。

由圖 2 可以看出，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖的效應較為顯著，其中黃豆餅粉的效應最大，硫酸銨其次，葡萄糖在三者中效應最小。

2.1.3殘差分析由圖 3 可以看出，效價殘差的正態(tài)性檢驗概率圖符合正態(tài)分布規(guī)律，直線的相關系數達到了95.88%，在殘差與擬合值圖中，殘差無規(guī)則地在水平軸上下隨機波動（圍繞 0），沒有出現絕對數超過 3 個標準差的異常點［12］，說明模型的適合性較好。

圖2　標準化效應的 Pareto 圖

2.2混料設計

2.2.1混料實驗安排及結果13 次混料試驗［13］中，三種原材料的配比見表 3，其他原材料按照 2.1 Plackett-Burman設計結果中的效應正負取相應的數值，考察三種原料按不同比例對效價和細菌濃度的影響。

由表 3 的結果可以看出，三種原料按不同的比例混合對效價和細菌濃度有著不同的影響。效價最大值出現在第4 次實驗運行中，為 3329 U/ml；細菌濃度最大值出現在第2 次實驗運行中，為 57%。

2.2.2不同原材料配比對效價的影響利用 Minitab 軟件中的混料設計分析選項可對實驗結果進行分析擬合，模型中的分量項為完全立方模式，舍棄掉不顯著項（P ＞ 0.05）AD、ABD 和 BD（B - D）之后，得到關于效價和原料的模型如下：

模型的 F 值為 27.38，P 值為 0.011，說明模型能較好地反映實際，模型方程的相關系數 r2= 98.74%，說明方程擬合度較高，在實驗范圍內該模型方程能夠較準確地解釋響應值的變化情況，可用來進行響應值分析和下一步預測。

混料設計可以根據各組分的三元等值線圖［14］直觀地觀察各組分間的變化對指標的影響，通過響應的等值線圖，可以直觀地看出原材料的不同配比對響應值的影響變化趨勢，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖的比例變化對于效價的等值線圖見圖 4。

由圖 4 可以看出，不同的配比對效價有著不同的影響，在硫酸銨取值較大時效價取較小值，隨著硫酸銨比例的減少，效價值越來越大，最大的效價取值出現在兩個區(qū)域，分別在黃豆餅粉和葡萄糖取較大值時。

圖3　效價殘差圖

表3　混料設計實驗安排及結果

圖4　效價的混合等值線圖

圖5　細菌濃度的混合等值線圖

2.2.3不同原材配比對細菌濃度的影響同樣利用 Minitab中的分析混料設計功能，模型中的分量項為二次［15］，得到關于細菌濃度和原料的模型方程：

表4　目標響應設置

模型的 F 值為 11.03，P 值為 0.005，說明模型能較好地反映實際，模型方程的相關系數 r2= 95.3%，說明方程擬合度較高。

通過響應的等值線圖，可以直觀地看出原材料的不同配比對響應值的影響變化趨勢，黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖的比例變化對于細菌濃度的等值線圖見圖 5。

由圖 5 可以看出，在黃豆餅粉取較大值時細菌濃度取較小值，硫酸銨取較大值時細菌濃度也取較大值，而細菌濃度為 40% 出現在三角等值圖的中間區(qū)域。

2.2.4響應值的優(yōu)化基于建立的擬合度較高的模型方程［16］，利用 Minitab 中的響應優(yōu)化器功能，可以求得在所研究區(qū)域內獲得目標響應值時的各組分具體取值，在響應優(yōu)化器的參數設定各個指標的優(yōu)化目標，具體目標設置如表 4。

通過響應優(yōu)化器功能，得到最優(yōu)解為黃豆餅粉 = 0.0262626，硫酸銨 = 0.0196400，葡萄糖 = 0.0540974。響應值效價= 3225.13，合意性 = 0.912626，細菌濃度 = 39.97，合意性 = 0.999078；復合合意性 = 0.954874。

2.3驗證實驗

為了檢驗模型對各個參數的優(yōu)化效果，在所確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比下進行了五個批次的實驗，最佳培養(yǎng)基配方和實驗結果見表 5 和表 6。

由表 5 和表 6 可以看出，在 Minitab 設計的最佳培養(yǎng)基配方的條件下，各個批次實驗的效價（Y）與模型效價的相對誤差均小于 3.0%，平均相對誤差為 1.58%，說明模型預測與實際取值較為吻合。五個批次的平均效價為3335.30 U/ml，與 Plackett-Burman 設計中的平均效價為2803 U/ml 相比提高了 18.9%，而五個批次的菌濃分別為38%、40%、36%、41% 和 42%，均在 40% 左右，未出現明顯偏差，實驗穩(wěn)定性較好，具有可重復性，說明混料設計優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基配比對于效價的提高和目標細菌濃度值的獲得有著較好的效果。

表5　最佳培養(yǎng)基配方

表6　最佳配方條件下實驗結果

3　討論

本研究首先利用 Plackett-Burman 設計篩選出影響效價的最主要因素（黃豆餅粉、硫酸銨和葡萄糖），然后進行混料試驗設計與數據分析，利用 Minitab 軟件的繪圖功能直觀地觀察出響應值隨變量的變化趨勢，最后利用響應優(yōu)化器功能確定模型方程的最值點，也就是所研究因子水平范圍內的響應值的目標點?；炝显O計中的單純形格子設計能夠將實驗點取在正規(guī)單純形的格點上，這樣就保證了選取的實驗點能夠均勻分布，且計算快捷準確，從而在各個行業(yè)被廣泛采用［17］。利用 Minitab 軟件進行實驗設計，其本質上是一種合理安排實驗和科學分析實驗數據的數理統計過程，可以對實驗點進行科學合理設計［18］，實驗的規(guī)模較小，實驗的成本低，實驗的次數也較少，設計簡單快捷，實驗周期短，效率高，能夠得到理想的實驗結果和正確的結論。

鏈霉素雖然是一種老產品，但是由于其獨特的優(yōu)點，成為一種常見的抗生素類殺菌劑，可以防治細菌病害，目前在國內外仍有巨大的市場。但是目前鏈霉素發(fā)酵生產存在著諸多問題，關鍵之一就是要解決生產成本，合理安排培養(yǎng)基組成和配比，提高產量和產品質量，但是由于其發(fā)酵工藝復雜，很難完全靠單一方法解決，因此將化學方法、儀器分析、生物分析和計算機模擬相結合是未來發(fā)展趨勢。

［1］ Heibei Shengxue Dacheng Pharmacentical Co.， Ltd. A Streptomycin high yield strain and screening method： China， CN201310242675.2. 2013-09-11. （in Chinese）

河北圣雪大成制藥有限責任公司. 一種鏈霉素高產菌株及其篩選方法： 中國， CN201310242675.2. 2013-09-11.

［2］ Li HY， Liu L， Wang SY. Optimization of fermentation medium for streptomycin production with streptomyces griseus. Sci Technol Eng，2013， 13（27）：8202-8205. （in Chinese）

李海燕， 劉蕾， 王思遠. 灰色鏈霉菌產鏈霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化.科學技術與工程， 2013， 13（27）：8202-8205.

［3］ Zhang L， Li YC， Chen Q. Optimization of the mixture design of fomula for water-soluble cores. J Huazhong Univ Sci Tech （Nat Sci Ed）， 2011， 39（3）：6-9. （in Chinese）

張龍， 李遠才， 陳琦. 水溶性型芯配方的混料設計優(yōu)化. 華中科技大學學報（自然科學版）， 2011， 39（3）：6-9.

［4］ Min YN. Application guide of design of experiments （DOE）. Beijing：China Machine Press， 2011：1-10， 336-357. （in Chinese）

閔亞能. 實驗設計（DOE）應用指南. 北京： 機械工業(yè)出版社，2011：1-10， 336-357.

［5］ Liu PX， Li SL， Li YG， et al. Formulation optimization of Bacillus marinus wettable powder. Chin J Pesticide Sci， 2014， 16（2）：206-212. （in Chinese）

劉盼西， 李淑蘭， 李元廣， 等. 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑配方的優(yōu)化. 農藥學報， 2014， 16（2）：206-212.

［6］ Li HY， Liu L， Guan LJ. Rapid determination of streptomycin in broth by spectrophotometry. Sci Technol Eng， 2013， 13（20）：6011-6014. （in Chinese）

李海燕， 劉蕾， 關麗杰. 分光光度法測定發(fā)酵液中鏈霉素的效價.科學技術與工程， 2013， 13（20）：6011-6014.

［7］ Castro IA， Tirapegui J， Silva RSF. Protein mixtures and their nutritional properties optimized by Response Surface Methodology. Nutr Res， 2000， 20（9）：1341-1353.

［8］ Castro IA， Silva RSF， Tirapegui J， et al. Simultaneous optimization of response variables in protein mixture formulation： constrained simplex method approach. Int J Food Sci Technol， 2003， 38（2）：103-110.

［9］ Mao J， Yin H， Cui C， et al. Based on Minitab confirmed most appropriate parameter of design of experiment. Coal Mine Machinery，2008， 29（8）：14-16. （in Chinese）

毛君， 尹航， 崔闖， 等. 基于Minitab確定最佳參數的實驗設計. 煤礦機械， 2008， 29（8）：14-16.

［10］ Liang Y， Lu WY， Wen JP. Application of Minitab software on the optimization of spinosad fermentation. Chin J Antibiot， 2008， 33（11）：659-662， 688. （in Chinese）

梁艷， 盧文玉， 聞建平. Minitab軟件在多殺菌素發(fā)酵條件優(yōu)化中的應用. 中國抗生素雜志， 2008， 33（11）：659-662， 688.

［11］ Liu J. Optimization of pullulan fermentation process by response surface method. Changchun： Jilin Agricultural University， 2011. （in Chinese）

劉杰. 響應面法優(yōu)化茁霉多糖的發(fā)酵工藝. 長春： 吉林農業(yè)大學，2011.

［12］ Mechti W， Mnif T， Chaabouni M， et al. Formulation of blended cement by the combination of two pozzolans： calcined clay and finely ground sand. Construction Building Mater， 2014， 50：609-616.

［13］ Han FG， Qiu JL. Application of mixture design in the sintering proportioning test. Sintering Pelletizing， 2011， 36（3）：10-13. （in Chinese）

韓鳳光， 邱金龍. 混料設計在燒結配礦試驗中的應用. 燒結球團，2011， 36（3）：10-13.

［14］ Zhai JG， Xie GQ， Li XL， et al. Copolyamide hot-melt adhesive with low melting point prepared by mixture design. China Adhes， 2015，24（11）：637-641. （in Chinese）

翟金國， 謝國慶， 李曉雷， 等. 混料設計制備低熔點共聚酰胺熱熔膠. 中國膠粘劑， 2015， 24（11）：637-641.

［15］ Lin ZX， Zhang HM， Yan LS， et al. Mixture design optimization of cellulase complex formulation. Food Sci， 2009， 30（15）：169-171. （in Chinese）

林增祥， 張紅漫， 嚴立石， 等. 混料試驗設計在纖維素酶復配中的應用研究. 食品科學， 2009， 30（15）：169-171.

［16］ Yang C， Lu DY， Xu ZZ. Optimization of the mix proportion in the ternary cementitious system of cement-steel slag-GBFS based on mixture design. Bull Chin Ceramic Soc， 2015， 34（8）：2107-2112. （in Chinese）

楊超， 盧都友， 許仲梓. 基于混料試驗設計的水泥-鋼渣-礦渣三元膠凝體系的配比優(yōu)化. 硅酸鹽通報， 2015， 34（8）：2107-2112.

［17］ Miao LL， Zhu JL， Li JR. Optimization of compound inhibitors of formaldehyde in the jumbo squid （Dosidicus gigas） based on mixture design. Sci Technol Food Ind， 2012， 33（8）：348-351. （in Chinese）

苗林林， 朱軍莉， 勵建榮. 基于混料實驗設計優(yōu)化魷魚甲醛復合抑制劑. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（8）：348-351.

［18］ Tsai JS， Lin YS， Pan BS， et al. Antihypertensive peptides and γ-aminobutyric acid from prozyme 6 facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk. Process Biochemistry， 2006， 41（6）：1282-1288.

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.016

272000 濟寧，山東魯抗醫(yī)藥集團研發(fā)中心

金偉，Email：jinwei0538@163.com

2016-03-09