馬偉瓊， 謝琦， 張鼎旋， 湯間儀， 雷正賢， 楊逸銘

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

新型超順磁性氧化鐵標(biāo)記SD大鼠脂肪干細(xì)胞的有效性及安全性研究

馬偉瓊， 謝琦， 張鼎旋， 湯間儀， 雷正賢， 楊逸銘

目的：采用新型超順磁性氧化鐵對(duì)SD大鼠來(lái)源的脂肪干細(xì)胞(ADSCs)進(jìn)行標(biāo)記，并與既往商用SPIO標(biāo)記效果進(jìn)行對(duì)比，探討這種新型超順磁性氧化鐵標(biāo)記的有效性及安全性。方法：分離、純化、鑒定SD大鼠來(lái)源的ADSCs，然后分不同濃度組(0、6、12、25、50和100 μg/mL)和時(shí)間組(6、12、24和48 h)進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)普魯士藍(lán)染色測(cè)定鐵標(biāo)記率；在不影響細(xì)胞形態(tài)的前提下，對(duì)達(dá)到95%以上鐵染色率的孵育濃度、時(shí)間進(jìn)行標(biāo)記安全性檢測(cè)，包括活力、增殖力、細(xì)胞表面抗原表達(dá)；采用透射電子顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，采用ICP-AES對(duì)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的鐵含量進(jìn)行測(cè)定，并與商用SPIO標(biāo)記效果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果：在無(wú)細(xì)胞毒性的前提下，新型SPIO達(dá)到95%以上鐵染色率的孵育濃度是12和25 μg/mL，孵育時(shí)間是12 h；ICP-AES檢測(cè)顯示具有表面正電荷的聚乙二醇(PEG)/聚乙烯亞胺(PEI)修飾的SPIO標(biāo)記后細(xì)胞內(nèi)的鐵含量達(dá)到35.4 pg/cell(25 μg/mL中孵育12h后)和20.16 pg/cell(12 μg/mL中孵育12h后)，并隨著孵育濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量增加；而具有表面零電荷的PEG/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修飾的SPIO標(biāo)記后的鐵含量?jī)H為6.96 pg/cell(25 μg/mL中孵育12h后)；透射電子顯微鏡顯示標(biāo)記后細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)吸收的SPIO主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的囊泡和溶酶體中。結(jié)論：新型SPIO在適當(dāng)孵育濃度和時(shí)間下可以安全、快速標(biāo)記ADSCs； PEG/PEI修飾的SPIO標(biāo)記效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)比既往商用的SPIO快速有效，可作為一種優(yōu)勢(shì)的新型磁性標(biāo)記物用于干細(xì)胞標(biāo)記；而PEG/PVP修飾的SPIO比起既往商用的SPIO并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明表面電荷在細(xì)胞標(biāo)記中占有極其重要的角色。

新型超順磁性氧化鐵； 脂肪干細(xì)胞； 染色與標(biāo)記； 鐵含量； 表面電荷

由于磁性氧化鐵納米材料具有良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性以及生物降解性等特點(diǎn)，因而被廣泛用于干細(xì)胞標(biāo)記領(lǐng)域[1-2]。目前干細(xì)胞示蹤成像的磁性氧化鐵納米材料主要采用商用的Resovist、Feridex等，但它們都是由化學(xué)共沉淀方法制備的，普遍存在粒徑不均勻、容易團(tuán)聚的缺點(diǎn)，性能有提升的空間[3]。此外，由于細(xì)胞膜和商用的超順磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide，SPIO)均為負(fù)電荷,必須與帶有正電荷的商用轉(zhuǎn)染劑(eg、脂質(zhì)體、多聚賴氨酸、硫酸魚(yú)精蛋白等)結(jié)合起來(lái)才能有效標(biāo)記干細(xì)胞，這種結(jié)合存在復(fù)雜的相互反應(yīng)[4，5]，會(huì)導(dǎo)致表面性能的不精確和大小的不完全一致，這勢(shì)必會(huì)引起標(biāo)記效果的差異性。

本研究擬采用的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)修飾SPIO是以高溫多元醇法合成的，在合成過(guò)程中就通過(guò)表面涂層修飾對(duì)納米粒子的表面性能進(jìn)行了精細(xì)控制，具有結(jié)晶度高、尺寸分布均勻、磁性強(qiáng)、生物相容性好的特點(diǎn)，并且具有固定的表面正電荷[6]。筆者猜測(cè)這種具有固有表面正電荷的新型SPIO也許能更有效地應(yīng)用于干細(xì)胞標(biāo)記領(lǐng)域，本研究將其對(duì)SD大鼠來(lái)源的脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)進(jìn)行標(biāo)記，并與既往商用SPIO標(biāo)記效果進(jìn)行對(duì)比，探討這種新型超順磁性氧化鐵標(biāo)記的有效性及安全性。本研究實(shí)驗(yàn)組還引入用相同方法合成的帶表面固定零電荷的PEG/聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)修飾的SPIO進(jìn)行對(duì)照標(biāo)記，以探索表面電荷在標(biāo)記有效性中的作用。

實(shí)驗(yàn)方法

1.SD大鼠ADSCs的提取、純化、鑒定

取4周齡以內(nèi)的SD大鼠(購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，無(wú)菌條件下取腹股溝處的脂肪組織，反復(fù)沖洗，剪碎成大約1 mm3的細(xì)小組織塊；加入I型膠原酶(Sigma公司)進(jìn)行恒溫振蕩消化，中止消化后進(jìn)行離心，種植在含10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM/F12(Hyclone公司)培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為原代細(xì)胞(P0)，以1：2的比例傳代，純化提取出ADSCs，傳代到P3代備用。

取P3代的培養(yǎng)細(xì)胞，用FACScan 流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD FASCantoTM)進(jìn)行表面抗原CD29、CD45、CD44 、CD106(Biolegend公司)的檢測(cè)。

2.新型SPIO標(biāo)記后ADSCs形態(tài)的觀察和有效孵育時(shí)間、濃度的初步選定

SPIO由桂林理工大學(xué)張寶林教授團(tuán)隊(duì)以PEG作為溶劑，以乙酰丙酮合鐵為鐵源，加入PEI、PVP作為表面涂層修飾劑制成氧化鐵納米粒子水溶液[6]。

取6孔板，細(xì)胞鋪板，設(shè)置不同濃度(0、6、12、25、50和100 μg/mL)和不同時(shí)間(6、12、24和48 h)組孵育，然后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)，隨機(jī)選擇視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，其中含藍(lán)色顆粒的細(xì)胞為標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算標(biāo)記陽(yáng)性率，分別計(jì)數(shù)3次取平均值，初步選定達(dá)到95%以上的標(biāo)記率且細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變的孵育濃度和時(shí)間。

3.標(biāo)記細(xì)胞的安全性檢測(cè)

細(xì)胞活力：將未標(biāo)記組和標(biāo)記組的單細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以1:1比例混勻，3 min內(nèi)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后計(jì)算活細(xì)胞率(%)。

細(xì)胞增殖力：將未標(biāo)記組和標(biāo)記組的細(xì)胞分別在1、3、5 d進(jìn)行MTT試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每孔吸去20 μL培養(yǎng)液，加入MTT 20 μL，同上條件繼續(xù)孵育4 h后棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，室溫下于圓周震蕩器震蕩10 min，酶標(biāo)儀選用雙波長(zhǎng)(570、630 nm)測(cè)量各孔的光密度(optical density，OD)值，每孔重復(fù)測(cè)3次，減去空白孔后取均值，繪制出生長(zhǎng)曲線。

細(xì)胞表面抗原表達(dá)：將未標(biāo)記組和標(biāo)記組的細(xì)胞加入熒光標(biāo)記的大鼠來(lái)源CD29、CD45、CD44 、CD106抗體，進(jìn)行細(xì)胞表面抗原表達(dá)的檢測(cè)。

4.透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM )觀察

將標(biāo)記后的細(xì)胞用2.5%戊二醛(預(yù)冷)4 ℃固定6 h，然后用1%鋨酸固定2.5 h，梯度乙醇脫水，滲透、包埋、聚合，常規(guī)超薄切片(70 nm)，用鉛鈾染色2 h，使用透射電子顯微鏡(日本 JEM1230)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，包括SPIO所在部位以及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器的完整性。

5.電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的鐵含量

將標(biāo)記后一定數(shù)量(106)的細(xì)胞放置在15 mL玻璃管內(nèi)，在每個(gè)樣品中加入65%～68%的濃硝酸，保持121℃高溫高壓反應(yīng)，使樣本充分溶解呈溶液。設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)樣品分別為:空白、0.1、1、10、50、100(PPm)，進(jìn)行ICP-AES定量檢測(cè)。根據(jù)其定量結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出單細(xì)胞鐵含量。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，標(biāo)記組和未標(biāo)記組的臺(tái)盼藍(lán)拒染率、MTT吸光度差異的比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　不同濃度PEG/PEI修飾的SPIO孵育不同時(shí)間點(diǎn)ADSCs的形態(tài)變化和鐵標(biāo)記率測(cè)定

結(jié)　果

1.SD大鼠來(lái)源ADSCs的提取、純化和鑒定

ADSCs呈多角形、紡錘形、梭形貼壁生長(zhǎng)，HE染色顯示細(xì)胞核位于細(xì)胞中間，細(xì)胞梭形突起相互連接，呈融合生長(zhǎng)(圖1)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示P3代ADSCs對(duì)CD29的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，達(dá)到95%以上；對(duì)CD44的表達(dá)為陽(yáng)性，為30%～40%；對(duì)CD106、CD45表達(dá)為陰性，表達(dá)小于5%(圖2)。

2.ADSCs的有效孵育時(shí)間、濃度的觀察和初步選定

細(xì)胞內(nèi)鐵標(biāo)記率隨著濃度和孵育時(shí)間的增加而增加，同時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)也隨著孵育濃度與時(shí)間的增加而改變，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)變形、皺縮、胞膜溶解的現(xiàn)象(表1、2、圖3)。

PEG/PEI修飾SPIO標(biāo)記組在12 μg/mL、25 μg/mL濃度下孵育12 h后即可得到95%以上的標(biāo)記率，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變(表1、圖3a、b)。而PEG/PVP修飾SPIO標(biāo)記組在25 μg/mL、50 μg/mL濃度下孵育12 h后即可得到95%以上的標(biāo)記率，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變(表2、圖3)，并且發(fā)現(xiàn)PEG/PVP修飾SPIO標(biāo)記組隨著標(biāo)記濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒增加并不明顯，只積聚在細(xì)胞質(zhì)邊緣靠近胞膜的區(qū)域。

3.標(biāo)記安全性檢測(cè) (有效標(biāo)記濃度和時(shí)間，細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變的前提下)

臺(tái)盼藍(lán)染色：臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，25 μg/mL標(biāo)記組2孵育48 h，50 μg/mL標(biāo)記組2孵育12、24和48 h后，ADSCs的活力較未標(biāo)記細(xì)胞組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組與未標(biāo)記組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

增殖力檢測(cè)：增殖力曲線趨勢(shì)圖顯示，12 μg/mL、25 μg/mL PEG/PEI修飾的SPIO標(biāo)記組孵育12 h后，25 μg/mL PEG/PVP修飾的SPIO孵育12 h后，增殖力曲線與未標(biāo)記組生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯差異，其余標(biāo)記組增殖力曲線下降(圖4)。

經(jīng)過(guò)標(biāo)記率、細(xì)胞活力和增殖力的檢測(cè)，選擇PEG/PEI修飾的SPIO孵育濃度為12 μg/mL、25 μg/mL，PEG/PVP修飾的SPIO孵育濃度為25 μg/mL，孵育時(shí)間均為12 h；細(xì)胞表面抗原表達(dá)檢測(cè)、電鏡觀察均選擇該孵育濃度和時(shí)間。

細(xì)胞表面抗原表達(dá)鑒定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示標(biāo)記后的ADSCs對(duì)CD29的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，達(dá)到95%以上；對(duì)CD44的表達(dá)為陽(yáng)性，為30%～40%；對(duì)CD106、CD45表達(dá)為陰性，表達(dá)均<5%，與未標(biāo)記組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2b)。

注：標(biāo)記組1是PEG/PEI修飾的SPIO標(biāo)記組；標(biāo)記組2是PEG/PVP標(biāo)記組。P值為各標(biāo)記組與未標(biāo)記組的比較結(jié)果。

4.TEM觀察

SPIO標(biāo)記后，內(nèi)吸收的氧化鐵納米顆粒均位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)，主要位于溶酶體內(nèi)，呈囊泡樣聚集改變，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)納米顆粒。PEG/PEI修飾的SPIO標(biāo)記細(xì)胞組內(nèi)沉積的囊泡數(shù)量要比PEG/PVP修飾的SPIO多，幾乎蔓延了整個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，而后者主要聚集于靠近細(xì)胞膜的區(qū)域(圖5)；從電鏡圖片來(lái)看，胞核不規(guī)則，染色質(zhì)較均勻，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本完整，內(nèi)吸收的納米顆粒對(duì)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。

5.SPIO的性能特性

將既往商用SPIO的材料性能特性與本研究中的新型SPIO進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　多醇法合成的SPIO和既往商用的SPIO性能特性對(duì)比

討　論

1.多醇法合成的SPIO的性能評(píng)價(jià)

PEG由于其較高的水溶性，并且無(wú)抗原性和免疫原性而可作為高溫多元醇法中的溶劑使用，在合成的SPIO表面進(jìn)行PEG涂層修飾，不僅能提高SPIO在水中的溶解性，而且能讓納米粒子在溶液中穩(wěn)定分散[7]。PEI是一種含有大量氨基的陽(yáng)離子聚合物，它一方面能夠有效地中和膠體液中過(guò)量的負(fù)電荷，尤其是在酸性或者中性環(huán)境下；另一方面其包含的多量氨基能夠與不同的物質(zhì)相結(jié)合，從而使得合成的SPIO結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，生物相容性和弛豫率亦有所提高[8]。PVP是一種兩親性聚合物，Lu等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)這種以PVP為涂層的氧化鐵納米粒子溶解性和穩(wěn)定性更高，在不同的有機(jī)溶劑和不同PH值的水溶液中(包括PBS液)中穩(wěn)定分散。

而本研究中的新型SPIO是以PEG作為溶劑，以乙酰丙酮合鐵(Fe(acac)3)為鐵源，加入PEI、PVP作為表面涂層修飾劑制成[6]，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可以分散于水溶液中，一步合成水溶性的SPION；②結(jié)晶性好，磁性強(qiáng)；③粒徑分布均勻，分散性好，基本沒(méi)有出現(xiàn)團(tuán)聚的現(xiàn)象。

2.高溫多元醇法合成的SPIO與既往商用SPIO在標(biāo)記有效性上的對(duì)比評(píng)價(jià)

本研究發(fā)現(xiàn)這種新型SPIO在12～25 μg/mL孵育濃度，12 h的孵育時(shí)間下即可達(dá)到95%以上鐵標(biāo)記率而無(wú)細(xì)胞毒性，而既往商用SPIO與轉(zhuǎn)染劑結(jié)合后要達(dá)到有效標(biāo)記率的孵育濃度為25～50 μg/mL，孵育時(shí)間為18～24 h[10]，說(shuō)明這種新型SPIO能更快速有效地標(biāo)記干細(xì)胞；考慮是由于納米粒子水動(dòng)力學(xué)粒徑小于100 nm，大小分布均一，有利于細(xì)胞對(duì)其吸收[4]，并且表面修飾涂層的空間位阻以及粒子間的靜電斥力阻止了粒子間的團(tuán)聚，使得納米粒子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，進(jìn)一步促進(jìn)了納米粒子的吸收和內(nèi)化[11]。

隨后的ICP-AES檢測(cè)對(duì)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的鐵含量進(jìn)行測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了這種新型SPIO在細(xì)胞標(biāo)記領(lǐng)域的有效性。既往研究表明，F(xiàn)eridex在沒(méi)有轉(zhuǎn)染劑結(jié)合的情況下，25 μg/mL中孵育24 h后，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量為0.6～1.5 pg/cell[12,13]，加入了一定濃度的多聚賴氨酸(polylysine,PLL)結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量可達(dá)到10 pg/cell[10,12]。由于Resovist的水動(dòng)力學(xué)粒徑要小于Feridex，能更有效地促進(jìn)粒子的吸收和內(nèi)化[12]，因此在相同的孵育濃度和時(shí)間條件下，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量可達(dá)到0.92～4.00 pg/cell[12,14]，與PLL結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量上升為17.9 pg/cell[5]。與此對(duì)比，PEG/PEI修飾的SPIO在25 μg/ml中孵育12 h后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的鐵含量達(dá)到35.4 pg/cell；即使在12 μg/mL中孵育12 h，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量也可達(dá)到20.16 pg/cell。因此，無(wú)論是從標(biāo)記的濃度和時(shí)間，還是細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的鐵含量來(lái)衡量，都提示本研究中的PEG/PEI修飾的SPIO比商用的SPIO能更加快速有效地標(biāo)記細(xì)胞。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)PEG/PEI修飾的SPIO標(biāo)記效果要比PEG/PVP修飾的SPIO明顯，前者在不影響細(xì)胞生物活性的前提下，隨著孵育濃度和時(shí)間增加，細(xì)胞標(biāo)記率提高，細(xì)胞內(nèi)鐵染色量和鐵含量亦增加；而PEG/PVP修飾的SPIO雖然在25 μg/ml的濃度下孵育12 h后達(dá)到95%以上的標(biāo)記率，但隨著標(biāo)記濃度的增加，普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒增加并不明顯，只積聚在細(xì)胞質(zhì)邊緣靠近胞膜的區(qū)域，隨后的ICP-AES測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鐵含量?jī)H達(dá)到6.96 pg/cell，標(biāo)記效果與既往商用的SPIO對(duì)比并無(wú)優(yōu)勢(shì)；考慮是因?yàn)榧?xì)胞標(biāo)記不僅僅與納米粒子的直徑大小有關(guān)，還依賴粒子化學(xué)特性和表面電荷情況。有研究表明在外源性的納米材料向細(xì)胞內(nèi)輸送過(guò)程中，增加表面電荷能夠促使納米粒子的吸收和內(nèi)化[11]。本研究中PEG/PEI修飾的氧化鐵納米粒子表面為正電荷，而PEG/PVP修飾的納米粒子表面卻是零電荷[4]，并不利于納米粒子向細(xì)胞內(nèi)的輸送，說(shuō)明表面電荷在細(xì)胞標(biāo)記中占有極其重要的角色。

3.標(biāo)記的安全性評(píng)價(jià)

納米顆粒表面涂層結(jié)構(gòu)修飾除了影響細(xì)胞的標(biāo)記率，還會(huì)影響細(xì)胞毒性作用。Thorek等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，在10～50 μg/ml濃度下的SPIO孵育后，只有少量的可以忽略不計(jì)的細(xì)胞出現(xiàn)死亡，但在SPIO進(jìn)行了胺化的涂層后，即使是在10 μg/ml的濃度下，都表現(xiàn)出了一定程度的細(xì)胞毒性，這種細(xì)胞毒性隨著孵育濃度的增加而加劇。因此本研究將達(dá)到有效標(biāo)記率的孵育濃度和時(shí)間進(jìn)行了細(xì)胞毒性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)新型SPIO在適宜濃度和時(shí)間的條件下孵育后，不僅細(xì)胞活力、增殖力無(wú)明顯改變，而且相應(yīng)的ADSCs表面抗原表達(dá)能力與未標(biāo)記組差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此考慮該孵育濃度和時(shí)間孵育后對(duì)干細(xì)胞的生物學(xué)活性無(wú)明顯抑制作用。

一般來(lái)說(shuō)，標(biāo)記的安全性不僅需要評(píng)定標(biāo)記對(duì)宿主細(xì)胞生物學(xué)活性的抑制作用，還得考慮內(nèi)吸收的納米鐵顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)如何代謝降解。目前普遍認(rèn)為具有明顯生物相容性的SPIO應(yīng)該是可以通過(guò)物理鐵代謝和利用的途徑進(jìn)行降解的[15]?，F(xiàn)有的研究表明，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的氧化鐵納米粒子是作為元素鐵被代謝的，部分通過(guò)水解酶代謝，但主要還是在溶酶體的酸性條件下被代謝的[14]。因此納米粒子通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，先位于細(xì)胞質(zhì)中的溶酶體倉(cāng)，然后再分發(fā)到細(xì)胞核周?chē)哪遗菀约敖K極溶酶體中，通過(guò)生物體的組織中的分子蛋白，溶酶體中的元素鐵可被儲(chǔ)存或者進(jìn)一步合成血紅蛋白而降解，從而始終維持生物體內(nèi)的鐵平衡，本研究用透射電子顯微鏡對(duì)SPIO標(biāo)記細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示內(nèi)吸收的SPIO主要位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的囊泡和溶酶體內(nèi)，并且標(biāo)記后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞器未見(jiàn)明顯破壞，進(jìn)一步說(shuō)明了SPIO的標(biāo)記是安全有效的。

本研究結(jié)果顯示這種由高溫多元醇法合成的新型SPIO在適當(dāng)孵育濃度和時(shí)間下可以安全、快速地標(biāo)記ADSCs。這種具有固定表面正電荷的PEG/PEI修飾的新型SPIO標(biāo)記效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)比既往商用的SPIO快速有效，并隨著孵育濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的鐵含量增加，可作為一種新型的磁性標(biāo)記物用于干細(xì)胞標(biāo)記；而具有固定表面零電荷的PEG/PVP修飾的SPIO比起既往商用的SPIO并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明表面電荷在細(xì)胞標(biāo)記中占有極其重要的角色。

[1]Albukhaty S,Naderi-Manesh H,Tiraihi T.In vitro labeling of neural stem cells with poly-L-lysine coated super paramagnetic nanoparticles for green fluorescent protein transfection[J].Iranian Biomedical J,2013,17(2):71.

[2]Khurana A,Nejadnik H,Chapelin F,et al.Ferumoxytol:a new,clinically applicable label for stem-cell tracking in arthritic joints with MRI[J].Nanomedicine,2013,8(12):1969-1983.

[3]楊文勝，高明遠(yuǎn)，白玉白.納米材料與生物技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：53-177.

[4]Jo J,Aoki I,Tabata Y.Design of iron oxide nanoparticles with different sizes and surface charges for simple and efficient labeling of mesenchymal stem cells[J].J Controlled Release,2010,142(3):465-473.

[5]Liu G,Yang H,Zhang XM,et al.MR imaging for the longevity of mesenchymal stem cells labeled with poly-L-lysine-Resovist complexes[J].Contrast Media Mol Imaging,2010,5(2):53-58.

[6]Zhao F,Zhang B,Wang J,et al.Synthesis and properties of magnetite nanoparticles coated with poly (ethylene glycol) and poly (ethylene imine)[J].J Nanosci Nanotechnol,2013,13(10):6793-6797.

[7]Ammar S,Helfen A,Jouini N,et al.Magnetic properties of ultrafine cobalt ferrite particles synthesized by hydrolysis in a polyol medium Basis of a presentation given at Materials Discussion No.3,26-29 September,2000,University of Cambridge,UK[J].J Materials Chemistry,2001,11(1):186-192.

[8]Brus C,Petersen H,Aigner A,et al.Physicochemical and biological characterization of polyethylenimine-graft-poly (ethylene glycol) block copolymers as a delivery system for oligonucleotides and ribozymes[J].Bioconjugate Chemistry,2004,15(4):677-684.

[9]Lu X,Niu M,Qiao R,et al.Superdispersible PVP-coated Fe3O4nanocrystals prepared by a "One-Pot" reaction?[J].J Physical Chemistry B,2008,112(46):14390-14394.

[10]Kim TH,Kim JK,Shim W,et al.Tracking of transplanted mesenchymal stem cells labeled with fluorescent magnetic nanoparticle in liver cirrhosis rat model with 3T MRI[J].Magn Reson Imaging,2010,28(7):1004-1013.

[11]Thorek DL,Tsourkas A.Size,charge and concentration dependent uptake of iron oxide particles by non-phagocytic cells[J].Biomaterials,2008,29(26):3583-3590.

[12]Mail?nder V,Lorenz MR,Holzapfel V,et al.Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents[J].Mol Imaging Biol,2008,10(3):138-146.

[13]Suh JS,Lee JY,Choi YS,et al.Efficient labeling of mesenchymal stem cells using cell permeable magnetic nanoparticles[J].Biochem Bioph Res Com,2009,379(3):669-675.

[14]Ittrich H,Lange C,T?gel F,et al.In vivo magnetic resonance imaging of iron oxide-labeled,arterially-injected mesenchymal stem cells in kidneys of rats with acute ischemic kidney injury:Detection and monitoring at 3T[J].J Magn Reson Imaging,2007,25(6):1179-1191.

[15]Barrow M,Taylor A,Murray P,et al.Design considerations for the synthesis of polymer coated iron oxide nanoparticles for stem cell labelling and tracking using MRI[J].Chem Soc Rev,2015,44(19):6733-6748.

The research of effectiveness and safety on SD rat adipose-derived stem cells labeled with a new type of superparamagnetic iron oxide nanoparticles

MA Wei-qiong,XIE Qi,ZHANG Ding-xuan，et al.

Department of Medical Imaging,Guangzhou First People′s Hospital/Nansha Central Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China

Objective：The aim of the present study was to explore the efficacy and safety of a new type of superparamagnetic nanoparticles (SPION) by labeling the SD rat adipose-derived stem cells (ADSCs) with SPION and comparing with our previous research results on commercial superparamagnetic iron oxide (SPIO).Methods:First,the SD rat ADSCs were incubated and labeled by different concentration groups (0,6,12,25,50,100μg/mL,respectively) and by different time groups (6,12,24,48h,respectively) after isolation,purification and identification.The labeling rate of iron oxide nanoparticles were detected by prussian blue staining.Second,the safety of high labeling efficacy (>95%) in ADSCs were evaluated,under the condition of not affecting the cell morphology,with viability,proliferation,surface makers identification and neuronal induction.Third,the ultrastructure of labeled ADSCs were oberved by transmission electron microscopy (TEM).Fourth,the iron content of labeled ADSCs were measured with ICP-AES and compared with our previous research results on commercial SPIO.Results:Under the premise of with no cytotoxicity,the incubation concentration for high labeling efficiency (>95%) of the new SPIO were 12 and 25μg/mL at the incubation time of 12h.The ICP-AES measurements showed that the iron content in ADSCs was 35.4pg/cell or 20.16pg/cell at the incubation of PEG/PEI SPIO which carried permanent positive surface charge, whereas only 6.96pg/cell at the incubation of PEG/PVP SPIO (25μg/mL,12h).TEM imaging showed that the cellular ultrastructure was intact,and the nanoparticles uptake was dominantly located in the vesicles and lysosomes.Conclusion：At the incubation of appropriate concentration and time,ADSCs can be safely and quickly labeled with new type of paramagnetic nanoparticles.Compared with the commercial SPIO，the new type of PEG/PEI SPIO trends to be a more advantaged magnetic tracer to label stem cells.In contrast,the advantage of PEG/PVP SPIO is not apparent,which indicates that surface charge have played an extremely important role in stem cell magnetic labeling.

New type of superparamagnetic nanoparticles; Adipose derived stem cells; Staining and labeling; Iron content; Surface charge

510180廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院/廣州市南沙中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像部(馬偉瓊、謝琦、張鼎旋、湯間儀、雷正賢、楊逸銘)；516001廣東，惠州市中心人民醫(yī)院放射科(馬偉瓊)

馬偉瓊(1986-)，女，廣東梅州人，碩士研究生，醫(yī)師，主要從事神經(jīng)影像診斷與分子影像學(xué)研究工作。

2014廣州市南沙區(qū)經(jīng)貿(mào)科技與信息化局民生科技項(xiàng)目基金(2014MS01)；2014廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目(20141A010015)；2015廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目科學(xué)專項(xiàng)(一般項(xiàng)目)基金(1563000424)及2015廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目技術(shù)開(kāi)發(fā)類基金(2014A020212034)

R814.3

A

1000-0313(2016)05-0386-07

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.05.001

2015-10-29

2016-01-11)