沈莉萍，徐　鋒，寧　昆，王曉旭，劉佩紅（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上?！?01103）

上海市屠宰生豬丹毒絲菌、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌分離情況調(diào)查

沈莉萍，徐鋒，寧昆，王曉旭，劉佩紅
（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103）

為了解上海市屠宰場屠宰生豬丹毒絲菌、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌的分離情況，采取傳統(tǒng)方法進行細菌分離，利用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)、全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)、普通PCR方法進行細菌鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬丹毒絲菌分離率為61%，豬鏈球菌分離率為7%，副豬嗜血桿菌分離率1%；豬丹毒絲菌從肺臟、扁桃體中均分離到，分離率高，豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌從扁桃體中分離到，分離率低。

屠宰生豬；豬丹毒絲菌；豬鏈球菌；副豬嗜血桿菌；上海

豬丹毒絲菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌的天然定植部位均為豬上呼吸道。當(dāng)豬機體抵抗力下降或者發(fā)生免疫抑制病時，這些細菌會作為致病菌侵入機體導(dǎo)致發(fā)病，影響豬的生長，嚴重的會導(dǎo)致豬突然死亡，給豬場造成經(jīng)濟損失。豬扁桃體位于消化道和呼吸道的交匯處，是多種病原微生物侵襲、復(fù)制和定居的重要場所，采集豬扁桃體樣品，可以進行豬群疫病病原感染狀況的調(diào)查。近年來，大部分豬場都對豬病毒病比較關(guān)注，而忽視了對細菌病的預(yù)防和控制。本研究旨在調(diào)查上海市屠宰場屠宰生豬的肺臟和扁桃體中上述三種細菌的分離情況，為豬場進行細菌病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源。2015年4月采集A、B屠宰場屠宰生豬肺臟和扁桃體各10份，共40份；10月采集A、C屠宰場屠宰生豬肺臟和扁桃體各15份，共60份。所有樣本放置冷藏箱運到實驗室，當(dāng)天進行檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑。麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、明膠、卡那霉素、新霉素、萬古霉素等，購自北京陸橋技術(shù)有限公司；Columbia血瓊脂基礎(chǔ)、疊氮鈉血瓊脂基礎(chǔ)，購自BD公司；輔酶Ⅰ（NAD），購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；脫纖維羊血，購自閔行區(qū)諸翟無菌動物血試劑供應(yīng)站；馬血清（HyClone），購自Thermo；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；Premix購自TaKaRa公司；革蘭氏陽性細菌鑒定卡（GP）、質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)溶液（VITEK MSCHCA），購自生物梅里埃公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株。副豬嗜血桿菌HP80由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株SS2 由德國吉森大學(xué)Baljer 教授惠贈；豬丹毒絲菌C43-5購自中監(jiān)所。

1.1.4 儀器。全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）、全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（VITEK MS）、普通PCR儀（BioRad PTC-200）、恒溫箱（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理。用滅菌剪刀和鑷子采集屠宰生豬扁桃體和肺臟組織于采樣袋中；樣品經(jīng)滅菌生理鹽水沖洗后進行檢測。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng)。第一步，副豬嗜血桿菌分離培養(yǎng)。無菌采取扁桃體和肺臟組織涂抹接種于Columbia血平板（含1 μL/mL NAD），在5% CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36 ℃培養(yǎng)48 h，對可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢；挑取單個菌落接種于Columbia血平板（含1 μL/mL的NAD）進行純培養(yǎng)，觀察菌落特征、染色特點。第二步，豬鏈球菌分離培養(yǎng)。無菌采取扁桃體和肺臟組織，先涂抹，后劃線接種于Columbia血平板，在5% CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h，對可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢；挑取單個菌落接種于Columbia血平板進行純培養(yǎng)，觀察菌落特征、染色特點。第三步，豬丹毒絲菌分離培養(yǎng)。無菌剪取扁桃體和肺臟組織各約1 g，加入9 mL TSB（含5%的馬血清、400 mg/L卡那霉素、50 mg/L新霉素、25 mg/L萬古霉素）中，36 ℃培養(yǎng)18～24 h。用接種環(huán)挑取增菌肉湯接種到疊氮鈉血瓊脂基礎(chǔ)（2%脫纖維綿羊血和5%馬血清），在5% CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24～48 h，對可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢；挑取單個菌落接種于Columbia血平板進行純培養(yǎng)，觀察菌落特征、染色特點。

1.2.3 生化試驗和細菌鑒定。對疑似豬丹毒絲菌分離株接種于麥康凱、三糖鐵、明膠培養(yǎng)基，觀察其培養(yǎng)特性。對疑似豬丹毒絲菌和豬鏈球菌的分離株，采用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）和全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（VITEK MS）按照操作步驟進行鑒定，讀取鑒定結(jié)果。

1.2.4 PCR檢測。首先，進行細菌基因組DNA的提取。用煮沸法制備DNA 模板，挑取數(shù)個菌落于含100 μL ddH2O的EP管中，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清作為模板，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。其次，引物合成、反?yīng)體系和條件。分別合成豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌引物［1-2］（表1），PCR反應(yīng)體系均為25 μL。豬鏈球菌反應(yīng)體系為：premix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物各0.5 μL，模板2 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。副豬嗜血桿菌反應(yīng)體系為：premix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物各1 μL，模板2 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃1.5 min，擴增30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。

表1　豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌PCR引物序列

2　結(jié)果

疑似豬鏈球菌分離株在Columbia血平板上為灰白色、濕潤、表面光滑、邊緣整齊、α溶血、1 mm大小的菌落，革蘭氏染色鏡檢為G+球形或橢圓形、短鏈。將疑似分離株進行豬鏈球菌二重PCR檢測，結(jié)果在4月份的10份扁桃體樣品中檢測到7份陽性，經(jīng)VITEK2-Compact和VITEK MS鑒定，均為豬鏈球菌。

疑似副豬嗜血桿菌分離株在Columbia血平板（含NAD）上為不溶血、半透明、針尖大小菌落，革蘭氏染色鏡檢為G- 細桿、呈長桿至長絲狀。將疑似副豬嗜血桿菌分離株進行PCR檢測，結(jié)果在4月份的10份扁桃體樣品中檢測到1份陽性，其余均為陰性。

疑似豬丹毒絲菌分離株在疊氮鈉血瓊脂基礎(chǔ)上為圓形、灰色、1～2 mm大小，有透明溶血圈菌落，革蘭氏染色鏡檢為G+ 呈平直、微彎曲桿菌或長絲狀；在Columbia血平板上為圓形、光滑、半透明、針尖大小菌落，培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)狹窄綠色溶血環(huán)（需對光觀察）；在麥康凱上不生長，在三糖鐵瓊脂上斜面和底層變黃，底部黑色，有H2S產(chǎn)生；明膠穿刺22 ℃培養(yǎng)72 h，明膠不液化，有的細菌呈試管刷狀生長，經(jīng)VITEK2-Compact和VITEK MS鑒定，均為豬丹毒絲菌。

從時間看（表2），4月份的扁桃體樣品中分離到豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和豬丹毒絲菌，分離率分別為14%、2%和55%；4月份的肺臟樣品中分離到豬丹毒絲菌，分離率為20%；10月份的扁桃體和肺臟樣品中均分離到豬丹毒絲菌，分離率高，沒有分離到豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌。

表2　不同時間屠宰生豬細菌檢測結(jié)果

從不同屠宰場看（表3），3家屠宰場分離到豬丹毒絲菌，2家屠宰場分離到豬鏈球菌，1家屠宰場分離到副豬嗜血桿菌，僅1家屠宰場的扁桃體樣品中同時分離到3種細菌。

表3　不同屠宰場屠宰生豬細菌檢測結(jié)果

3　討論

豬丹毒診斷技術(shù)（NY/T 566—2002 ）中分離豬丹毒絲菌的培養(yǎng)基為馬丁瓊脂和馬丁肉湯［3］，而本研究采用含有一定濃度的馬血清、抗生素的TSB進行增菌，含羊血和馬血清的疊氮鈉血瓊脂基礎(chǔ)進行豬丹毒絲菌分離。事實證明，由于樣品來源于屠宰車間，污染大，通過用滅菌生理鹽水進行沖洗，在含有抗生素的TSB中增菌，降低了雜菌污染的風(fēng)險，在含羊血和馬血清的疊氮鈉血瓊脂基礎(chǔ)進行分離，雜菌少，豬丹毒絲菌的溶血圈大，菌落大，易于觀察，不易漏檢；使用Columbia血平板進行純培養(yǎng)，培養(yǎng)時間長，菌落小，溶血圈為狹窄的綠色溶血環(huán)，需對光觀察。因此，對于樣品污染嚴重，可按照上述方法進行豬丹毒絲菌的增菌和分離，對病料，可直接選擇疊氮鈉血瓊脂基礎(chǔ)進行分離培養(yǎng)。

據(jù)報道，豬丹毒絲菌可以在健康豬的扁桃體中潛伏，扁桃體中的帶菌率為24.3%～70.5%［4］，本研究的3家屠宰場中有2家分離率大于40%以上，與傅啟勇等［5］報道的52%、60%、70.45%分離率相吻合。豬丹毒絲菌目前共有25個血清型，從健康豬的扁桃體可分離出不同的血清型［6］。本研究所分離的菌株屬于哪些血清型，是否致病，需下一步對此展開研究。

從扁桃體中均分離到豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和豬丹毒絲菌，而且3家屠宰場生豬扁桃體樣品中豬丹毒絲菌的分離率比肺臟樣品中高，因此建議采集屠宰生豬的扁桃體同時進行三種細菌的分離，以減少工作量；扁桃體采集質(zhì)量要多，采集后迅速進行實驗室檢測，可提高檢出率。另外，在4月份均分離到這3種細菌，而在10月份僅分離到其中1種細菌。原因有可能是上海市4月份正是初春季節(jié)，氣候多變，晝夜溫差大，對豬應(yīng)激大，育肥豬多處于亞健康狀態(tài)，攜帶的細菌多，而10月份氣候溫暖干燥，育肥豬健康。因此在4月份比10月份更容易分離這3種細菌。屠宰場中B屠宰場同時分離到3種細菌，C屠宰場分離到其中1種細菌。追蹤屠宰生豬來源發(fā)現(xiàn)，C屠宰場屠宰生豬均來自同一企業(yè)自繁自養(yǎng)育肥豬，B屠宰場來自不同養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖環(huán)境、飼養(yǎng)管理模式不同，分離的細菌也不同。

豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌的天然定植部位是豬上呼吸道，尤其扁桃體，但本研究的分離率非常低，尤其副豬嗜血桿菌僅分離到1株。張悅等［7］在2013—2014年從上海市5家屠宰場采集的8批次鼻拭子和病變肺組織樣品中，僅從2家屠宰場的3批次分離到副豬嗜血桿菌，分離率為12%～20%，其余5批次沒有分離到副豬嗜血桿菌，養(yǎng)殖場疑似病料分離率也僅為29.3% 。這可能與豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌培養(yǎng)條件要求嚴格有關(guān)。尤其副豬嗜血桿菌培養(yǎng)條件苛刻，在室溫下僅少量存活，需要在體內(nèi)環(huán)境中生長［8］，體外存活時間短，樣品需要在沒有使用抗生素之前采集。目前沒有找到添加何種抗生素可進行副豬嗜血桿菌增菌，直接進行平板培養(yǎng)，如果采集的樣品污染嚴重，則分離更加困難。今后需加強對豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌增菌培養(yǎng)的研究。

本研究曾采集屠宰生豬鼻拭子進行檢測。但是在樣品采集過程中發(fā)現(xiàn)，生豬屠宰都是流水線操作，棉簽僅采集鼻腔淺表部位，無法深入到鼻腔深部，雜菌多，導(dǎo)致目的菌的分離工作量大，難度大，極易漏檢，檢測結(jié)果不確實。因此，屠宰生豬鼻拭子不適宜進行細菌分離。

［1］ 萬世平，王建，葛菲菲，等.副豬嗜血桿菌PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2009，30（1）：9-12.

［2］ 李小軍.上海地區(qū)豬鏈球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病學(xué)調(diào)查［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［3］ 農(nóng)業(yè)部. 豬丹毒診斷技術(shù)：NY/T 566—2002［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

［4］ 宣長和. 豬病學(xué)［M］.2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：109.

［5］ 傅啟勇，張孟剛，范翔九，等.豬丹毒桿菌的公共衛(wèi)生學(xué)意義的研究--動物帶菌率與環(huán)境污染情況的調(diào)查［J］.中國人畜共患病，1985（2）：9-12.

［6］ 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：181-182

［7］ 張悅，李蓓蓓，魏建超，等.上海副豬嗜血桿菌分離鑒定及其耐藥性分析［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2015，23（4）：25-30.

［8］ 趙德明，張仲秋，周向梅. 豬病學(xué)［M］.10版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2014：800-801.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Investigation of Erysipelothrix Rhusiopathiae，Streptococcus Suis and
Haemophilus Parasuis in Commercially Slaughtered Pigs from Shanghai City

Shen Liping，Xu Feng，Ning Kun，Wang Xiaoxu，Liu Peihong
（Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103）

To investigate the prevalence of Erysipelothrix rhusiopathiae，streptococcus suis haemophilus parasuis from commercially slaughtered pigs in Shanghai. Bacteria was isolated by the traditional method and identified by automatic microbial identification system，organisms rapid identification system and PCR.The isolation rate was 61% for Erysipelothrix rhusiopathiae，7% for Streptococcus suis and 1% for Haemophilus parasuis.Erysipelothrix rhusiopathiaes showed a higher isolation rate on lung and tonsil，while streptococcus suis and haemophilus parasuis can only be isolated from tonsil and showed a lower separation rate.

commercially slaughtered pigs；erysipelothrix rhusiopathiae；streptococcus suis；haemophilus parasui；Shanghai

S851.3

B

1005-944X（2016）08-0031-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.008

上海地區(qū)主要動物病原微生物種質(zhì)資源保存利用（滬農(nóng)科攻字〔2014〕第7-3-3號）

劉佩紅