王偉芹　高占華　尹常健　孫建光　張　永

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病科，濟(jì)南　250014）

柔肝抑纖飲對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠TGF-β1、Sm ad4表達(dá)的影響

王偉芹高占華尹常健孫建光張永

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病科，濟(jì)南250014）

目的觀察柔肝抑纖飲對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1、Smad4表達(dá)的影響。方法60只W istar大鼠除空白對照組外，余建立CCL4性肝纖維化模型，隨機(jī)分為模型組、柔肝抑纖飲組和復(fù)方鱉甲軟肝片組。實(shí)驗(yàn)8周后，處死動物，檢測血清ALT、AST及肝組織勻漿HA、PCⅢ水平。行肝組織Masson染色及TGFβ1、Smad4免疫組化染色，陽性結(jié)果計(jì)算機(jī)定量分析。結(jié)果模型組大鼠血清ALT、AST，肝勻漿HA、PCⅢ，以及肝組織Masson染色陽性面密度和Smad4、TGFβ1免疫組化陽性率均較空白對照組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；而柔肝抑纖飲組大鼠除血清ALT外，余指標(biāo)均較模型組降低（P＜0. 05，P＜0.01）。結(jié)論柔肝抑纖飲有明顯的抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制之一可能在于抑制TGF-β1、Smad4的表達(dá)。

柔肝抑纖飲；TGF-β1；Smad4；肝纖維化；動物實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)已證實(shí)，肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵是肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活及其激活后ECM異常表達(dá)，而HSC激活狀態(tài)的維持及產(chǎn)生纖維化的過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是最關(guān)鍵的致纖維化因子。有研究提出，TGF-β1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在HSC/ECM表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用是研究肝纖維化治療的關(guān)鍵。目前認(rèn)為［1］，阻斷TGF-β1的合成和信號是抗纖維化治療的主要目標(biāo)。我們既往研究已證實(shí)，柔肝抑纖飲有確切的抗肝纖維化作用，故進(jìn)一步探討其對TGF-β1/Smad表達(dá)的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1動物分組及處理SPF級W jstar大鼠，雌雄性各半，共60只，體重180～210 g，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（許可證號：SCXK（魯）20110003）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱重，編號，按分層隨機(jī)原則分為空白對照組、模型組、柔肝抑纖飲組和復(fù)方鱉甲軟肝片組。除空白對照組外，其余大鼠建立肝纖維化模型：首次腹部皮下注射CCL4分析純0.5 m1/100 g體重，以后每隔3天腹部皮下注射40%CCL4-花生油（V/V）制劑0.3 m1/100 g體重，連續(xù)8周。飼以普通飼料。柔肝抑纖飲組和復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠灌服相應(yīng)藥物濃縮劑（動物給藥量的標(biāo)準(zhǔn)參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》不同種屬動物間劑量換算的體表面積折算法［2］）連續(xù)8周。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥柔肝抑纖飲：雞血藤、當(dāng)歸、白芍、懷牛膝、三七粉沖服、小薊、鱉甲先煎、雞內(nèi)金、枸杞、水紅花子、茵陳、生甘草、薏苡仁、土鱉蟲、皂刺、大棗（大棗自備，余中藥均購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診中藥房）。復(fù)方鱉甲軟肝片：內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司（國藥準(zhǔn)字Z19991011）。

1.3生化試劑CCL4分析純（煙臺市雙雙化工有限公司，批號20100102）；市售花生油。即用型SABC免疫組化染色試劑盒、Rabbjt Antj-Smad4、TGF-β1一抗多克隆抗體（滴度：1∶50-200）均購自武漢博士德生物工程有限公司。HA、PCⅢ試劑盒購自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所。Masson試劑盒購于武漢谷歌生物科技有限公司。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血清指標(biāo)測定肝功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）采用全自動生化分析儀測定。

1.4.2肝組織勻漿指標(biāo)檢測取肝組織1 g左右制備肝勻漿，取上清液，放射免疫法測定HA、PCⅢ。

1.4.3肝組織病理染色觀察①HE染色：取新鮮肝組織經(jīng)10%中性甲醛48小時(shí)充分固定，梯度酒精脫水，二甲苯固定，石蠟包埋，制成4μm的石蠟切片。行蘇木素伊紅（HE）染色。②Masson三色染色：石蠟切片行Masson三色染色，膠原纖維呈藍(lán)色，紅細(xì)胞染紅色，胞核染藍(lán)黑色。③Smad4、TGF-β1免疫組織化學(xué)染色：切片脫蠟至水化，用SABC法染色，以3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原微波熱修復(fù)，5%BSA封閉液封閉，滴加稀釋（1∶100）一抗（兔IgG），4℃冰箱過夜，滴加生物素化二抗，滴加SABC試劑（鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物），DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5染色切片計(jì)算機(jī)定量分析用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（軟包為武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司商業(yè)提供），測得數(shù)據(jù)作t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)，所得均數(shù)作為該片測得數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以SPSS19.0 for W jndows統(tǒng)計(jì)軟包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料多樣本均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA），結(jié)果以（）表示。

2　結(jié)果

2.1血清ALT、AST改善情況見表1。

表1　各組大鼠血清ALT、AST改善情況?。?/p>

表1　各組大鼠血清ALT、AST改善情況　（

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

AST（U/L）123.76±21.81模型組　10　517.84±296.440**　720.26±349.34**柔肝抑纖飲組　8　373.43±139.77**　505.60±174.99**#復(fù)方鱉甲軟肝片組　8　355.39±161.61**#　532.05±156.67**#組別　動物數(shù)（只）　ALT（U/L）空白對照組　9　42.41±4.49

2.2肝組織勻漿HA、PCⅢ檢測情況見表2。

表2　各組大鼠肝組織勻漿纖維化指標(biāo)改善情況?。ǎ?/p>

表2　各組大鼠肝組織勻漿纖維化指標(biāo)改善情況　（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

PCⅢ（mg/m1）16.89±6.05模型組　8　99.91±18.41**　33.69±9.12**柔肝抑纖飲組　8　66.05±11.65##　19.48±5.69##復(fù)方鱉甲軟肝片組　8　67.58±12.46##　20.31±5.83##組別　動物數(shù)（只）　HA（ng/m1）空白對照組　8　64.88±11.39

2.3肝組織病理學(xué)觀察空白對照組：肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無肝細(xì)胞腫脹及脂肪變性，小葉內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤。模型組：肝細(xì)胞明顯腫脹變性，其中多為脂肪變性，肝小葉中央?yún)^(qū)明顯壞死，部分匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生，接近形成假小葉。用藥組：各用藥組肝細(xì)胞脂肪變性程度均較模型組明顯減輕，散在肝小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)見散在纖維結(jié)締組織增生。

2.4Masson三色染色觀察見表3。

表3　各組大鼠肝臟Masson三色染色陽性面密度比較?。?/p>

表3　各組大鼠肝臟Masson三色染色陽性面密度比較　（

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別　動物數(shù)（只）　陽性面密度空白對照組　8　0.113±0.075模型組　8　0.214±0.064**柔肝抑纖飲組　8　0.114±0.064##復(fù)方鱉甲軟肝片組　8　0.171±0.088

模型組：肝細(xì)胞廣泛脂肪變性，肝臟內(nèi)有大量纖維組織增生，形成纖維間隔寬窄不一，分割肝小葉，有形成假小葉的趨勢，個別已形成假小葉。膠原面密度較空白對照組具有顯著性差異（P＜0.01）。各用藥組：肝細(xì)胞脂肪變程度均較模型組輕，增生纖維纖細(xì)菲薄，著色較淡，未形成完全連接，不完全分割肝小葉，柔肝抑纖飲組與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.5肝組織免疫組化染色觀察

2.5.1TGF-β1陽性表達(dá)比較見表4、Fjg1。

空白對照組：微弱表達(dá)，肝細(xì)胞漿見均勻淡染棕黃色陽性顆粒。模型組：陽性著色明顯增強(qiáng)，尤以纖維增生組織和炎性細(xì)胞周圍多見（P＜0.05）。兩用藥組：陽性著色程度較模型組明顯減輕，而柔肝抑纖飲組TGF-β1陽性表達(dá)減輕最顯（P＜0.05），較空白對照組無差異（P＞0.05）。

表4　各組大鼠肝臟TGF-β1、Smad4陽性率比較?。ǎ?/p>

表4　各組大鼠肝臟TGF-β1、Smad4陽性率比較?。ǎ?/p>

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

Smad4 0.046±0.028模型組　8　0.136±0.078*　0.219±0.062**柔肝抑纖飲組　8　0.095±0.052#　0.108±0.037**##復(fù)方鱉甲軟肝片組　8　0.118±0.073*　0.1175±0.045**#組別　動物數(shù)（只）　TGF-β1空白對照組　8　0.056±0.046

圖1　各組大鼠肝臟TGF-β1免疫組化結(jié)果

2.5.2Smad4陽性表達(dá)比較見表4、Fjg2?？瞻讓φ战M：肝細(xì)胞及周圍組織中均呈低水平表達(dá)。模型組陽性表達(dá)主要分布于纖維間隔、匯管區(qū)、炎性細(xì)胞和肝竇Djssee間隙、肝細(xì)胞漿和間質(zhì)，呈點(diǎn)片狀，分散不連續(xù)，陽性率明顯高于空白組（P＜0.01）。兩用藥組：Smad4陽性表達(dá)較模型組減輕（P＜0.05，P＜0.01），以柔肝抑纖飲組最顯。

3　討論

正常狀態(tài)下肝星狀細(xì)胞（HSC）表達(dá)TGF-β1極少，損傷后表達(dá)顯著增加［3］。研究發(fā)現(xiàn)［4］在肝纖維化大鼠，隨著病程延長和肝纖維化的進(jìn)展，TGF-β1的表達(dá)逐漸上升，表明TGF-β1在肝纖維化過程中起重要作用，而TGF-β1/Smad信號通路過度活化與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］

TGF-β1主要依賴于其下游的一族高度保守的胞內(nèi)信號蛋白——Smad蛋白家族介導(dǎo)其信號傳遞，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。TGF-β1活化后與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合，激活Smads蛋白并形成復(fù)合物，由此轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與各種轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Smads蛋白是TGF-β信號傳導(dǎo)過程中最重要的胞內(nèi)效應(yīng)因子，是目前所知的細(xì)胞內(nèi)惟一的TGF-β受體激酶的底物，它能將TGF-β信號由胞膜轉(zhuǎn)入核內(nèi)，使TGF-β1發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，與肝纖維化密切相關(guān)的有受體激活型Smad2、3、4和抑制型Smad7。TGF-β1與胞膜表面的TGF-β受體Ⅱ結(jié)合后，激活TβRⅠ，使Smad2、Smad3磷酸化而活化，繼而與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，將信號從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。本研究證實(shí)，TGF-β1、Smad4在肝纖維化大鼠模型組中表達(dá)明顯高于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01）。

近年來，各地對肝纖維化的病機(jī)學(xué)提出過許多不同的見解，但在思路及方法上只注重從古人論述的黃疸、脅痛、積聚等病機(jī)中尋找答案，而未能從肝纖維化本身病變的廣泛性和階段性等總體規(guī)律上做出全面科學(xué)的總結(jié)。我們認(rèn)為只有以肝纖維化的發(fā)生發(fā)展為主線，用中醫(yī)學(xué)有關(guān)病機(jī)學(xué)理論進(jìn)行探討，才能總結(jié)出較為系統(tǒng)全面、具有階段性規(guī)律的病機(jī)學(xué)特點(diǎn)，也才能符合臨床實(shí)際。慢性肝炎肝纖維化、肝硬化肝纖維化的主要病機(jī)范圍，除具有病變廣泛性特點(diǎn)外，其病機(jī)轉(zhuǎn)歸具有一定的階段性規(guī)律，即初在肝，先傳脾，后及腎，最后導(dǎo)致氣血逆亂、正虛邪實(shí)的結(jié)局。瘀血阻絡(luò)貫穿于肝纖維化發(fā)生發(fā)展的始終，既是肝纖維化發(fā)展過程的病理產(chǎn)物，又是肝纖維化發(fā)生的重要病因。柔肝抑纖飲具有養(yǎng)陰柔肝，化瘀散結(jié)之功效，方中雞血藤、當(dāng)歸、鱉甲為君藥，滋陰養(yǎng)血，化瘀散結(jié)；白芍、枸杞子、牛膝、水紅花子、三七粉、雞內(nèi)金共為臣藥，輔助君藥養(yǎng)血、活血、散結(jié)之功效；茵陳、小薊、土鱉蟲為佐藥，在佐助君臣藥活血通絡(luò)的同時(shí)，又通過清熱解毒利濕，鏟除濕熱疫毒之余邪；生甘草、大棗共為佐使藥，在調(diào)和諸藥的同時(shí)，加強(qiáng)該方扶正之功效。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，柔肝抑纖飲能明顯降低肝組織中TGF-β1、Smad4的陽性表達(dá)率以及Masson染色的陽性面密度比值（P＜0.01，P＜0.05），同時(shí)降低大鼠血清中AST及肝組織中HA、PCⅢ的含量，提示該方具有明顯的抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制之一可能與抑制TGF-β1、Smad4的表達(dá)有關(guān)。

［1］Gressner AM，Weiskirchen R，Breitkopf K，Dooley S.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis［J］.FrontBiosci2002，7：d793-d807.

［2］徐淑云，芐如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

［3］Kinnman N，Andersson U，Hultcrantz.In situ expression of transforming growth factor-beta 1～3，latenttransforming growth factor-beta binding protein and tumor necrosis factor-alpha in liver tissue from patientswith chronic hepatitis［J］.Scand JGastroenterol，2000，35：1294-1300.

［4］胡杰，黃志宏，盧建遠(yuǎn)，等.CCL4肝纖維化大鼠TGF-β1表達(dá)的動態(tài)變化［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版，2010，36（1）：88-90.

［5］余曉紅，鄭穎娟，呂宏迪，等.TGFβ1/smad7信號通路在大鼠肝纖維化發(fā)生中的活化及意義［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2015，32（3）：261-263.

Effect of Rougan Yixian Decoction on the Expression of TGF-β1and Smad4 in the Experimental Rat GEpatic Fibrosis

WANG Weiqin， GAO Zhanhua， YIN Changjian， SUN Jianguang， ZHANG Yong
（DePartment of HePato1ogy， The Affi1iated HosPita1 of Shandong University of TCM， Ji'nan， 250014， China）

Objective To observe the effect of Rougan Yjxjan decoctjon on the expressjon of TGF-beta1 and Smad4 jn experjmenta1 rat hepatjc fjbrosjs.M ethods The 1jver fjbrosjs ratmode1was jnduced wjth carbon tertrach1orjde and besjdesmode1group.The rats of 1jver fjrbosjs were djvjded jnto mode1 group，Rougan Yjxjan decoctjon group andcompond Bjejja Ruangan tab1et group.After 8 weeks，a11 rats were kj11ed，and the jndexes were tested jn b1ood and 1jver.The posjtjve resu1ts were quantjtatjve ana1ysjs.Results Comparjngwjth the contro1group，the jndexes jn themode1group of the content of ALT，AST jn serum，the 1eve1of HA and PCⅢjn 1jver，the posjtjve area1densjty of 1jver co11ege and jmmunohjstochemjca1posjtjve rate of Smad4 and TGFβ1were a11hjgher（P＜0.05，P＜0.01）.In addjtjon to the serum ALT，the others jn Rougan Yjxjan decoctjon group were 1ower than those jn themode1group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion Rougan Yjxjan decoctjon had obvjous1y curatjve effect on antj-1jver fjbrosjs.The one ofmechanjsm of actjon was to contro1expressjon of the TGF-β1and Smad4.

Rougan Yjxjan decoctjon；TGF-β1；Smad4；1jver fjbrosjs；anjma1experjment

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.10.064

1672-2779（2016）-10-0140-03

（本文編輯：張文娟本文校對：閻小燕2016-03-25）