侯　宇　王　穎　王立娜　王杰瓊

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南　250355）

實(shí)驗(yàn)研究

鐵棍山藥中山藥多糖的提取與粗純化工藝初探※

侯宇王穎王立娜王杰瓊*

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250355）

目的據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道山藥多糖的提取方法較多，但收率不盡理想，本文旨在探討提高山藥多糖收率的恰當(dāng)方法。方法將鐵棍山藥去皮打漿，然后在60℃水浴加熱2 h；接著抽濾除去不溶物，采用sevage法去蛋白，并利用紫外分光光度計(jì)在260～280 nm是否有峰，判斷蛋白是否去除完全。之后，旋蒸除去溶劑；醇沉24小時(shí)后，抽濾，溶解沉淀物于清水中，冷干成粉，冷凍保存。結(jié)果采用苯酚——硫酸法測定山藥多糖粗提物中山藥多糖含量，含量為65.24%。結(jié)論采用本實(shí)驗(yàn)方法山藥多糖的提取率可明顯提高，說明本實(shí)驗(yàn)方法提取率高，可行性好，不失為山藥多糖的一種可行的方案。

山藥多糖；粗純化；工藝研究；鐵棍山藥

鐵棍山藥是河南焦作的著名特產(chǎn)之一，屬于四大懷藥（懷山藥、懷地黃、懷牛膝、懷菊花）的懷山藥中的極品。鐵棍山藥含薯蕷皂苷元、黏液質(zhì)、多糖、淀粉酶等成分，具有促消化、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能、降血糖等作用。山藥多糖目前已被證明具有降血糖、保護(hù)胰島細(xì)胞功能、抑制α-淀粉酶的酶活力、抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生等功能［1-2］。但是據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前山藥多糖的提取中對于山藥多糖粗提取的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并不多，且提取率偏低。因此本文通過綜合其他文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)際操作探討提高山藥多糖收率的方法。

1　材料

1.1原料鐵棍山藥：購自河南焦作，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為薯蕷科鐵棍山藥。

1.2試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑：氯仿、正丁醇、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖（均為國產(chǎn)分析純）。去蛋白混合液（氯仿：正丁醇=5∶1）

實(shí)驗(yàn)儀器：FA-1104N電子分析天平（上海精密儀器有限公司）；UV9100B可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；LDZ4-0.8型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；LGJ-18A冷凍干燥機(jī)；HW1C電熱恒溫水溫箱；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科工貿(mào)有限公司）；熱橙多功能食品破壁料理機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1山藥多糖的粗提取

2.1.1去皮打漿將山藥去皮后置于熱橙多功能食品破壁料理機(jī)中與純水以1∶20（g/m1）的比例放置在一起，打碎攪拌3mjn。

2.1.2熱水浸提打漿后將山藥勻漿轉(zhuǎn)移至多個(gè)2000 m1大燒杯中，放置于恒溫水浴鍋中，60℃熱水浸提2 h，取出，接著使用布氏漏斗，抽濾濾去不溶性物質(zhì)。

2.1.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)熱水浸提后的溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，于60℃，0.0825 Pa濃縮至原體積的1/5。

2.1.4Sevege去蛋白取上清液進(jìn)行去蛋白，選取氯仿：正丁醇=5∶1的比例制備去蛋白液，原液和去蛋白混合液以5∶1的比例混合，置于分液漏斗中每次劇烈搖晃15 m jn。之后，以3000 r/m jn的轉(zhuǎn)速離心10 m jn。取上層清液于潔凈細(xì)口瓶中備用。

2.1.5旋蒸溶劑將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空濃縮。

2.1.6紫外可見分光光度計(jì)檢測此時(shí)取少量樣液使用紫外分光光度儀在全波長段掃描于260 nm～280 nm處觀察沒有顯著峰（見圖一），說明蛋白去除完全。

2.1.7靜置醇沉在旋蒸后的上清液清液中加入四倍體積的無水乙醇，密封，置于4℃冰箱內(nèi)，醇沉24 h，24 h后使用布氏漏斗抽濾，使用乙醇洗三遍、乙醚洗兩遍，洗去雜質(zhì)。

2.1.8凍干成粉 將抽濾所得多糖粗品分多份溶于多份10 m1純水中，置于4℃冰箱中預(yù)凍24 h后，使用四環(huán)凍干機(jī)凍干成粉，冷凍保存。

2.2山藥多糖含量測定

2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備山藥多糖的檢測采用苯酚-硫酸法。稱取105℃干燥至恒重的分析純葡萄糖20 mg，溶于蒸餾水，定容至500 m1容量瓶中，分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0 m1葡萄糖溶液，用蒸餾水定容至2 m1于試管中。然后加入1 m16%的苯酚和5 m1濃硫酸，搖勻后，放于40℃水浴鍋中靜置10 mjn。隨后放置在裝有冷水錐形瓶中的冷卻至室溫，在490 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1Sevage去蛋白殘留檢測實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果如下圖所示：

圖1　Sevege去蛋白后紫外可見分光光度法蛋白殘留檢測

該圖像在260～280 nm內(nèi)無明顯吸收峰，故Sevage法去蛋白較徹底。

3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=64.651x+0.0327，R2=0.9988。

圖2　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3山藥提取物中山藥多糖含量的測定

表1　

根據(jù)公式及所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可得山藥多糖含量為：65.24%

4　討論與分析

于蓮［3］利用響應(yīng)面法進(jìn)行山藥多糖工藝優(yōu)化后，測得山藥多糖樣品多糖含有量為35.2%，姬承?。?］借助微波輔助提取和超聲波輔助提取方法，提取的山藥多糖含量達(dá)到50.8%，而徐琴［5］測得其含量為18.4%，以上幾種方法山藥多糖的提取效率都較低。

經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)山藥多糖的提取工藝中劉秀河［6］提出的山藥多糖最佳提取方案為浸提溫度為60～64℃，浸提3.2～3.5 h級料液比為1∶20。山藥多糖的提取率為58.40%。余芳［7］等通過單因素實(shí)驗(yàn)，利用超聲提取山藥多糖確定實(shí)驗(yàn)最佳條件為：水提溫度60℃、超聲波功率200W、水提時(shí)間30mjn、料液比1∶16。周垠輝［8］提出山藥多糖的較優(yōu)提取工藝為預(yù)處理時(shí)間（2+2）h，提取時(shí)間2 h，提取溫度60℃，物水比1∶20，提取次數(shù)1次得率為5.16%。

劉秀河［6］及周垠輝［8］實(shí)驗(yàn)所涉及的山藥多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)，確定水浴溫度為60℃時(shí)山藥多糖收率最高。經(jīng)周垠輝［8］和李鳳［9］確定當(dāng)浸提時(shí)間為2 h，料液比為1∶20時(shí)山藥多糖提取效率最好。

綜合以上文獻(xiàn)，對于山藥提取采用如下方案：浸提溫度為60℃，液料比為1∶20，浸提2 h。對于Sevage去蛋白法，姬承?。?］對山藥多糖去蛋白時(shí)氯仿和正丁醇的比例的確定，發(fā)現(xiàn)氯仿和正丁醇以5∶1的比例混合均勻較同體積去蛋白次數(shù)明顯小于劉秀河去蛋白液比例。因此氯仿正丁醇的比例確定為5∶1。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在打碎攪拌過程中部分鐵棍山藥勻漿發(fā)紅，根據(jù)目前現(xiàn)有資料，發(fā)紅（褐變）的原因是多酚氧化酶PPO及多酚類物質(zhì)的含量偏高，其中PPO可催化多酚聚合成黑色素。打漿后PPO與空氣接觸面積增大，更易發(fā)生催化，變紅加快。

同時(shí)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)通過本實(shí)驗(yàn)方法提取山藥多糖，其提取率明顯高于其他相關(guān)文獻(xiàn)的粗多糖提取率。說明本實(shí)驗(yàn)方法提取率高，可行性好。

［1］2 Diabetes Controland Complications Trim Research Group，Theeffectof intensive treatmentofdiabeteson the developmentandprogression of long telTn complications in insulin—‘dependentdiabetesUl［J］.N.En91.J.Med，1993，329：977-986.

［2］UK Prospective Diabetes Study Group.Intensive blood glucose controlwith sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patient with type 2diabetes（UKPDS33）［J］.lancet，1998，352：837-853.

［3］于蓮，張俊婷，馬淑霞，等.山藥多糖提取工藝優(yōu)化及其抗菌活性研究［J］.中成藥，2014藥，2014（6）：1194-1198.

［4］姬泓巍，郭會芹，張晶，等.山藥多糖提取分離工藝的研究［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010（7）：89-92.

［5］徐琴.江蘇產(chǎn)淮山藥多糖成分的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［6］劉秀河，吳艷，艾連中.山藥水溶性多糖提取工藝的研究［J］.食品與機(jī)械，2006（3）：21-23.

［7］余芳，蔣彩云，楊愛萍，等.山藥多糖提取與純化工藝研究［J］.中國調(diào)味品，2012（12）：50-53，64.

［8］周垠輝，諸愛士，馮晟.山藥多糖提取工藝研究［J］.浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（4）：323-326.

［9］李鳳，程道梅，金虹，等.鐵棍山藥水溶性粗多糖的提取工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（11）：4556-4557.

Discussion on lsolation and Purification of Polysaccharide from Chinese Yam

HOU Yu， WANG Ying， WANG Lina ， WANG Jieqiong*
（Co11ege of Pharmacy， Shandong University of Traditiona1 Chinese Medicine， Ji'nan 250355， China）

Objective Accordjng to reports jn the 1jterature，Chjnese yam po1ysaccharjde extractjonmethod jsmore，but the yje1d js not jdea1.Thjs artjc1e ajmed to exp1ore sujtab1e way to jncrease the effjcjency of yam po1ysaccharjde.M ethods Chjnese yam was pee1ed and beatjng，was heated for 2h jn 60℃water，used fj1tratjon to remove jnso1ub1ematter，sevagemethod js used to remove protejn，and by usjng u1travjo1et spectrophotometer jn 260-280nm peak to determjne whether protejn to remove comp1ete1y.Later，spjn steamjng was used to remove so1vent，after 24 hours of a1coho1sjnk，the suctjon fj1ter，djsso1ved sedjment jn c1ean water，co1d-dry jnto a powder and cryopreservatjon.Results Usjng the pheno1-su1furjc acjd method of yam po1ysaccharjde content jn the crude extractjngs from yam po1ysaccharjde，content js 65.24%.Conclusion The experjmentmethod of yam po1ysaccharjde can obvjous1y jncrease the extractjon yje1d，hashjgh extractjon yje1d and good feasjbj1jty，and can be regarded asa kjnd of feasjb1e scheme of yam po1ysaccharjde.

yam po1ysaccharjde；crude purjfjcatjon；techno1ogy research；Chjnese yam

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.10.063

1672-2779（2016）-10-0138-03

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練（SRT）計(jì)劃資助項(xiàng)目（No：2015111）

jieqiong19820127@163.com

（本文編輯：張文娟 本文校對：宋春紅2016-03-16）