李楊鈞　章　維.寧波市第二醫(yī)院肝膽、微創(chuàng)外科，浙江寧波　3500；.寧波市第二醫(yī)院消化科，浙江寧波　3500

Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

李楊鈞1章維2
1.寧波市第二醫(yī)院肝膽、微創(chuàng)外科，浙江寧波315010；2.寧波市第二醫(yī)院消化科，浙江寧波315010

目的探討Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)，并探討二者之間的相關(guān)性。方法選擇2013年12月～2015年12月在我院手術(shù)治療的膽管細(xì)胞癌患者40例（A組）手術(shù)標(biāo)本作為研究對象，同時(shí)取癌旁膽管組織30例（B組）。另外選取同期手術(shù)的10例正常組織（肝血管瘤旁正常肝內(nèi)膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常肝內(nèi)膽管組織）作為對照（C組）。比較各組Survivin與Caspase-3表達(dá)的陽性率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，及Survivin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與Caspase-3的相關(guān)性。結(jié)果Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的陽性率分別為75.0%、40.0%，其中Survivin在A組中的陽性率顯著高于B組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而Caspase-3在A組中的陽性率低于B組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Survivin、Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。膽管細(xì)胞癌中Survivin陽性30例，Caspase-3陽性16例，二者均為陽性7例，二者均為陰性1例，應(yīng)用相關(guān)分析顯示，Survivin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與Caspase-3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.723，P＜0.05）。結(jié)論Survivin在膽管細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率較高，但Caspase-3較低，二者呈負(fù)相關(guān)，考慮可能是Survivin抑制了Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對Survivin與Caspase-3的研究有助于深入了解膽管細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

膽管細(xì)胞癌；Survivin；Caspase-3；相關(guān)性

［Abstract］Objective To investigate the expression of Survivin and Caspase-3 in cho1angiocarcinoma and to exp1ore the corre1ation between the two.Methods 40 cases（group A）with cases of bi1e duct carcinoma were se1ected as the study subjects，and 30 cases（group B）were co11ected from the surgica1 treatment of cho1angiocarcinoma in our hospita1 during December 2013 to December 2015.In addition，10 cases of norma1 1iver tissue（norma1 intrahepatic bi1e duct tissue or 1iver injury after 1iver trauma）were se1ected as contro1 group（group C）.The re1ationship between the expression of Survivin and in each group，the re1ationship between the positive rate of Caspase-3 expression and the c1inicopatho-1ogica1 parameters，and the corre1ation between the expression of Survivin and the expression of Caspase-3 in cho1angiocarcinoma were compared.Results The positive rates of Survivin and Caspase-3 in cho1angiocarcinoma were 75.0% and 40.0%，respective1y.The positive rate of Survivin in group A was significant1y higher than that in group B and group C（P＜0.05）.And the positive rate of Caspase-3 in group A was 1ower than that of group B and group C（P＜0.05）. The expression of Caspase-3 and Survivin was c1ose1y re1ated to the degree of differentiation and 1ymph node metastasis，and the difference was statistica11y significant（P＜0.05）.Bi1e duct ce11 carcinoma survivin in 30 cases of positive，caspase-3 was positive in 16 cases，both were positive in 7 cases，two were negative in 1 case，the app1ication corre1ation ana1ysis showed that survivin in bi1e duct carcinoma and the expression of Caspase-3 was negative1y corre1ated （r=-0.723，P＜0.05）.Conclusion The positive expression of Survivin in ce11s of bi1e duct cancer rate is high，but caspase-3 is 1ow，the second is negative1y re1ated，consider possib1e is by inhibition of caspase-3 apoptosis mediated by Survivin.The research of Survivin and Caspase-3 he1ps to understanding the deve1opment mechanism of cho1ahgiocarcinoma.

［Key words］Cho1angiocarcinoma；Survivin；Caspase-3；Corre1ation

膽管細(xì)胞癌（cho1angiocarcinoma）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐年升高。膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與其他腫瘤一樣，其發(fā)生發(fā)展是多因素、涉及多基因改變和多階段致病的復(fù)雜過程［1］。隨著膽管細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)理研究的深入，已發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAps）家族中的一個(gè)新成員，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的凋亡抑制因子之一，具有抑制細(xì)胞凋亡，并通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞異常增殖的作用［2］。Survivin在人體內(nèi)幾乎所有的惡性腫瘤中均有表達(dá)，而在正常分化的成人組織中除子宮內(nèi)膜、胎盤和胸腺組織外無表達(dá)［3］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）是ICE家族重要成員，是細(xì)胞凋亡信號通路下游最主要的執(zhí)行分子之一，研究證實(shí)，Caspase-3廣泛分布于各種不同類型的細(xì)胞中，表達(dá)在多種正常組織中，包括淋巴結(jié)、骨髓、上皮等：在某些惡性腫瘤組織中也有表達(dá)［4］。近年來關(guān)于二者間的關(guān)系研究顯示，Survivin通過與微管蛋白形成復(fù)合物抑制凋亡蛋白酶Caspase-3的活性，從而抑制凋亡，同時(shí)具有抑制凋亡效應(yīng)蛋白酶Caspase-3活性、參與細(xì)胞周期調(diào)控及調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂等作用［5］。目前臨床關(guān)于二者在腫瘤中入胃癌、結(jié)腸癌、肝癌中表達(dá)的情況及相關(guān)性研究較多，但關(guān)于二者在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)研究報(bào)道較少，本研究旨在通過免疫組織化學(xué)（免疫組化）SP法檢測Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)，并探討二者之間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　對象與方法

1.1研究對象

選擇2013年12月～2015年12月在我院手術(shù)治療的膽管細(xì)胞癌患者40例手術(shù)標(biāo)本作為研究對象（A組），術(shù)前未行放化療，其中男22例，女18例，年齡28～78歲，平均（61.3±7.2）歲；其中≤60歲者10例，＞60歲者30例，分化程度：高分化6例，中分化10例，低分化24例。伴周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，轉(zhuǎn)移部位包括肝、膽囊、腸系膜、胰腺，十二指腸等。同時(shí)取癌旁膽管組織30例（B組），其中男16例，女14例，年齡28～76歲，平均（61.2±6.8）歲。另外選取同期手術(shù)的10例正常組織（肝血管瘤旁正常肝內(nèi)膽管組織或者肝外傷后切除肝組織的正常肝內(nèi)膽管組織）作為對照（C組），其中男6例，女4例，年齡28～72歲，平均年齡（52.8±6.7）歲；三組間的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2試劑與方法

1.2.1試劑濃縮型鼠抗人Survivin單克隆抗體、濃縮型兔抗人Caspase-3多克隆抗體、免疫組化S-P試劑盒（即用型），購自于北京中山生物技術(shù)有限公司。1.2.2免疫組化方法 常規(guī)脫蠟水化，采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法，均經(jīng)檸檬酸緩沖液高壓抗原熱修復(fù)預(yù)處理，經(jīng)顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽性的癌組織切片做陽性對照，代替一抗作陰性對照。脫蠟及水化：

1.3結(jié)果判定

Survivin陽性：膽管細(xì)胞漿或核呈棕黃色細(xì)顆粒：Caspase-3陽性：膽管細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒。采用半定量積分法：每項(xiàng)指標(biāo)隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性（-）；11%～25%為弱陽性（+）；26%～50%為中等陽性（++）；＞50%為強(qiáng)陽性（+++）；后三者視為陽性［6］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料采用四格表χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)情況

見表1。Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的陽性率分別為75.0%、40.0%，Survivin與Caspase-3在膽管癌的癌旁組織中的陽性率率分別為3.3%、80.0%，Survivin與Caspase-3在正常組織中的陽性率率分別為0、90.0%。其中Survivin在A組中的陽性率顯著高于B組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.398、4.562，P＜0.05）。而Caspase-3在在A組中的陽性率低于B組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.238、5.142，P＜0.05）。但Survivin和Caspase-3在B組、C組中的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.334、0.762，P＞0.05）。

表1　Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)情況［%（n/n）］

2.2Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及與臨床病理因素間的關(guān)系

見表2。Survivin、Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而與患者的年齡無關(guān)（P＞0.05）。

2.3膽管細(xì)胞癌中Survivin與Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性分析

見表3。膽管細(xì)胞癌中Survivin陽性30例，Caspase-3陽性16例，二者均為陽性7例，二者均為陰性1例，應(yīng)用相關(guān)分析顯示，Survivin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與Caspase-3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.723，P＜0.05）。

表2　Survivin與Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及與臨床病理因素間的關(guān)系

表3　膽管細(xì)胞癌中Survivin與Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性分析（n）

3　討論

膽管細(xì)胞癌的發(fā)生是多因素參與、多步驟、多階段的過程。研究發(fā)現(xiàn)，膽管細(xì)胞癌解剖位置特殊，惡性度高，且起病隱匿，預(yù)后差，與肝細(xì)胞肝癌相比更容易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與術(shù)后復(fù)發(fā)。近年來有數(shù)據(jù)表明：膽管細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率逐年增高［7］。

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）基因家族的新成員。Survivin的表達(dá)具有高度特異性，在胚胎組織高表達(dá)，而在正常成體組織，除了胎盤和胸腺之外，幾乎檢測不到［8］。在膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Survivin基因處在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分裂的交叉路口，可以同時(shí)控制這兩個(gè)在腫瘤發(fā)病中重要的細(xì)胞生命活動(dòng)過程［8］。目前已有研究者［9-15］證實(shí)Survivin參與了多種人類腫瘤如肺、胃癌、食管癌［5］、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、宮頸癌等的發(fā)生，但是目前國內(nèi)外對其與膽管細(xì)胞癌關(guān)系的研究較少。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測40例膽管細(xì)胞癌中Survivin的表達(dá)，結(jié)果顯示，Survivin在膽管細(xì)胞癌中的陽性率達(dá)75.0%，顯著高于癌旁組織和正常組織（P＜0.05）且Survivin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。與石曉巖等［16］報(bào)道的觀點(diǎn)是一致的，說明Survivin參與了膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程，極有可能在膽管上皮出現(xiàn)異常增生和分化時(shí)就已表現(xiàn)出活性。Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中最重要的執(zhí)行分子，是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)蛋白，被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的關(guān)鍵酶［17］。正常狀況下，胞質(zhì)中的Caspase-3無活性，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，它被系列反應(yīng)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［5］。有研究證實(shí)Caspase-3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤惡性轉(zhuǎn)移的重要原因［8］。

本研究中，Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中陽性率40.0%，低于癌旁組織和正常組織（P＜0.05）。且Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系（P＜0.05），說明 Caspase-3的表達(dá)與膽管細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Caspase-3在膽管細(xì)胞癌中的低表達(dá)促進(jìn)了膽管癌細(xì)胞的增殖，阻礙了其凋亡［19-21］。本研究同時(shí)對二者在膽管細(xì)胞癌中的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Survivin在膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)與Caspase-3呈負(fù)相關(guān)（r=-0.723，P＜0.05），說明Survivin和Caspase-3可能共同參與了膽管細(xì)胞癌的過程，Survivin是Caspase-3的直接抑制劑，通過抑制Caspase-3的活性而阻斷各種刺激誘導(dǎo)的凋亡過程［22-24］。許鵬等［25］也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

綜上，Survivin在膽管細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率較高，但Caspase-3較低，二者呈負(fù)相關(guān)，考慮可能是Survivin抑制了Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對Survivin 與Caspase-3的研究有助于深入了解膽管細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

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ExPression and correlation of Survivin and CasPase-3 in cholangiocarcinoma

LI Yangjun1ZHANG Wei2
1.Department of Minima11y Invasive Surgery，Ningbo No.2 Hospita1，Ningbo315010，China；2.Department of Gastroentero1ogy，Ningbo No.2 Hospita1，Ningbo315010，China

R735.8

A

1673-97O1（2O16）11-OO13-O4

浙江省寧波市第二批科技項(xiàng)目（2012A610198）

2016-01-28）