劉　娟　周炳榮　駱　丹　張家安　陶艷玲　苗穎穎　謝淑芬　范　曾　易　飛　吳紅巾　栗　丹　王　申

論 著

紫外線照射后生成的微囊泡對成纖維細胞氧化損傷及凋亡的作用

劉娟周炳榮駱丹張家安陶艷玲苗穎穎謝淑芬范曾易飛吳紅巾栗丹王申

目的： 明確對UVA及UVB照射后皮膚成纖維細胞生成的微囊泡對成纖維細胞氧化損傷及凋亡的作用。方法：紫外線照射人皮膚成纖維細胞，提取細胞上清液中的微囊泡，利用光散射分析技術鑒定分析微囊泡的大小及數(shù)量。將紫外線照射后生成的微囊泡與正常成纖維細胞共孵育，熒光酶標儀定量檢測活性氧含量，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果： UVA及UVB照射后皮膚成纖維細胞釋放的微囊泡數(shù)量及大小明顯高于正常成纖維細胞釋放的微囊泡。正常纖維細胞、UVA和UVB照射后的成纖維細胞與微囊泡共孵育后活性氧熒光值分別為（52.76±1.4347）、（82.60±4.082）和（85.94± 6.264），凋亡率分別為（3.260±1.732）%，（28.94±2.430）%和（34.48±2.718）%，細胞的氧化損傷和凋亡可被抗氧化劑逆轉。結論： 急性中長波紫外線照射可誘導皮膚成纖維細胞釋放微囊泡進一步介導細胞的氧化損傷和凋亡。

紫外線? 成纖維細胞? 微囊泡? 氧化損傷? 凋亡

近年來，多個研究顯示紫外線誘導的旁觀者效應確切存在［1，2］。研究者對此現(xiàn)象發(fā)生的機制也進行了研究：Widel等研究認為，活性氧的產生與紫外線誘導的旁效應的產生密切相關［2］?Ghosh等人的研究表明旁效應的產生與受輻射細胞分泌的因子有關，并且觀察到旁細胞抗氧化系統(tǒng)的激活［1，3］。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)UVB誘導的提前衰老的成纖維細胞上清液可對正常的細胞造成損傷，該上清液含有紫外線輻射細胞釋放的可溶性因子，介導了旁效應的發(fā)生［4，5］。有關這些活性因子通過何種途徑發(fā)揮作用，目前并沒有得到明確闡述，有研究者發(fā)現(xiàn)受到離子輻射的細胞可分泌外泌體（exsomes）及微囊泡（Microvescles，MVs），并通過囊泡的作用進行細胞間的信息傳遞［6］。囊泡在急性紫外線損傷中是否發(fā)揮作用，仍需要進一步的研究。本文通過研究受到急性中波及長波紫外線（UVA/UVB）輻射的人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSFB），收集、分離并鑒定細胞上清液中的MVs，并分析其對HSFB氧化損傷及凋亡的影響，以進一步揭示紫外線輻射誘導旁效應的發(fā)生機制。

1　材料與方法

1.1材料 胰酶購于美國Amresco公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，活性氧檢測試劑盒、抗氧化劑N乙酰L半胱氨酸（N acetyl L cysteine，NAC）、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1），hoechs33342t試劑盒購于江蘇碧云天生物技術研究所，PKH26熒光染料購于德國sigma公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，高速冷凍離心機購于德國eppendorf公司，UVA及UVB照射儀購于上海希格瑪高技術有限公司（ss-40，UVA發(fā)射波長320～400 nm，波峰365 nm，UVB發(fā)射波長280～320 nm，波峰311 nm），熒光酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細胞的分離、培養(yǎng)與傳代 修剪去除包皮皮下組織，剪成0.5 cm×0.5 cm皮塊，碘伏浸泡，0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，加入0.5%分散酶，4℃消化18～20 h后分離表、真皮。真皮部分以包皮消化液37℃消化5 min后，加入DMEM培養(yǎng)基，吹打、過濾，過濾后將細胞液離心，棄上清，加入含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，混勻并轉移至培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細胞密度約90%時進行傳代，將細胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，接種密度為1.0×106個/皿，細胞每天換液1次，取5～10代對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2無微囊泡血清的制備 胎牛血清在4℃條件下經10 000 g超速離心1 h，吸取上清?重復上述步驟1次，收集上清?收集的血清上清過0.22微米濾膜，除菌。配置成含10%血清的培養(yǎng)基，不加青鏈霉素。

1.2.3中長波紫外線照射 實驗分為3組。未輻射組：未經紫外線輻射，正常培養(yǎng)的HSFB?UVA輻射組（20 J/cm2）：UVA直接單次照射?UVB輻射組（60 mJ/cm2）：UVB直接單次照射。待細胞處于對數(shù)生長期后，密度約80%，開始進行紫外線照射。用UVA/UVB探測儀標定UVA/UVB照射儀的照射度，UVA/UVB劑量=UVA/UVB照射度×時間（s），培養(yǎng)皿距燈管距離15 cm，分別按照上述劑量一次性照射。每次照光前，每組用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，洗凈培養(yǎng)基，照光時用PBS替換培養(yǎng)基，照射后換經步驟2處理過后的含10%無MVs血清的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4培養(yǎng)基中微囊泡的提取及鑒定 吸取各組處理細胞培養(yǎng)24 h的上清液，先于4℃經2000 g離心20 min去除雜質及細胞碎片，再于4℃經10 000 g超速離心2 h，MVs可在離心管底壁沉集，用PBS仔細洗凈培養(yǎng)基后以PBS重懸（提取MVs的量設定為1 mL細胞上清液提取10μL MV，標記為CMVs=10 μL/mL），置于-80℃冰箱備用。提取的MVs分組為：未輻射組，UVA輻射組，UVB輻射組。采用光散射分析技術對提取的MVs進行分析鑒定，包括MVs的大小分布及數(shù)量的分析。

1.2.5細胞對微囊泡攝取的動態(tài)觀察 使用PKH26熒光染料對每組提取的MVs進行標記（染色標記方法按照說明書進行），hoechest33342t標記細胞核，使用共聚焦顯微鏡觀察不同時間點（30 min，3 h，24 h，48 h）成纖維細胞對MVs攝取的情況。并用熒光酶標儀于激發(fā)波551 nm，發(fā)射波557下行熒光值的檢測。

1.2.6活性氧檢測

1.2.6.1熒光顯微鏡觀察 將密度約為2×105/mL細胞接種于3.5 cm小皿中，次日細胞貼壁后進行細胞處理，將細胞隨機分組為對照組，未輻射組（加入未輻射組MVs孵育），UVA輻射組（加入UVA輻射組MVs孵育），UVA+NAC組（另加入抗氧化劑NAC），UVB組（加入UVB輻射組MVs孵育），UVB+NAC組（另加入抗氧化劑NAC）。抗氧化劑NAC的孵育濃度為1 mmol/L，每組加入的MVs量為60μL。孵育48 h后進行實驗。采用原位裝載探針的方法，以1∶1000比例稀釋相應探針，每皿加入1 mL稀釋液，37℃避光孵育20 min后PBS洗滌細胞3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6.2熒光酶標儀定量檢測 將HSFB以2000個/ 100μL接種于96孔板，置于5%CO2、37℃飽和濕度下培養(yǎng)?次日貼壁后同上處理，每孔加入10μLMVs。裝載探針后通過熒光酶標儀于激發(fā)波485 nm，發(fā)射波525 nm下行熒光值的檢測。

1.2.7細胞凋亡的檢測

1.2.7.1JC-1染色觀察線粒體膜電位的變化 將細胞制成1×105/mL細胞懸液接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。次日細胞貼壁后，對細胞進行處理，依據(jù)加入不同上清中提取的MVs將其分組為：未輻射組，UVA輻射組，UVA+NAC組，UVB組，UVB+NAC組，并設置對照組（僅使用新鮮培養(yǎng)基孵育的HSFB）。隨機選用兩組加入1 mmol/L的NAC孵育30 min。每組加入步驟4收集的相應MVs，加入的MVs量為60μL/皿，孵育48 h后換液1次，再加入步驟4收集的MVs 60μL，繼續(xù)孵育48 h后進行試驗。棄去原培養(yǎng)液，加入PBS洗3遍，按試劑說明書進行染色，染色后即刻熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7.2流式細胞儀膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞凋亡分組及處理同上，將各組細胞制成1×105/mL細胞懸液，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并處理后，離心收集至10 mL離心管中，PBS清洗3次，用100μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，離心收集細胞并去上清。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不停振動，上機檢測細胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計學方法 用SPSS 13.0軟件進行分析，兩組間比較用成組t檢驗，多組間行單因素方差分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1UVA/UVA輻射后HSFB分泌的MVs含量變化及大小分布范圍 HSFB可分泌一定量的MVs至上清液中，經過UVA/UVB輻射過后的細胞，其分泌更多量的MVs，用PBS將收集的MVs重懸后采用光散射分析技術對其進行分析，依據(jù)布朗運動原理，所有的粒子均被逐個分析，由此可區(qū)分外泌體及MVs，外泌體的直徑多在30～100 nm，MVs的直徑約在100～500 nm。分析表明我們收集的囊泡以MVs為主，正常細胞分泌的MVs直徑多在120～200 nm，而受到紫外線輻射后的細胞生成的MVs的直徑聚集在150～300 nm，且輻射細胞分泌的MVs的量明顯高于正常細胞所分泌的含量（圖1）。

圖1　正常HSFB及急性中長波紫外線輻射后HSFB培養(yǎng)上清液中收集、分離、提取的微囊泡含量，大小及分布范圍（藍色：對照組?紫色：UVA輻射組?青色：UVB輻射組）

2.2成纖維細胞攝取MVs的觀察 加入MVs后30 min監(jiān)測即可見細胞開始對其進行攝取，細胞核的周邊可見散在經PKH26標記呈現(xiàn)紅色熒光的MVs，隨著時間的推移，細胞對MVs的攝取逐漸增多，細胞核周邊可見較多量的MVs聚集，尤其以紫外線輻射組為著。30 min熒光酶標儀定量紅色熒光未輻射組（0.044±0.017）與UVA組（0.093±0.025）對比無明顯差異，但與UVB組的熒光值（0.182±0.064）對比差異有統(tǒng)計學意義?3 h，24 h，48 h紅色熒光定量未輻射組（0.070±0.017，0.685±0.138，0.973±0.319）與同時刻UVA組（0.438±0.170，4.01±0.552，6.732±0.822）及UVB組（1.271±0.244，8.088±0.837，11.853±1.553）對比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?而同時刻的UVA組及UVB組熒光值對比差異均無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）見圖2。

2.3細胞內活性氧含量變化 共聚焦顯微鏡下觀察，UVA輻射組及UVB輻射組細胞活性氧熒光強度明顯高于對照組及未輻射組。熒光酶標儀檢測熒光值，紫外線輻射組均高于未輻射組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?對照組與未輻射組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖3，表1。

表1　熒光酶標儀檢測各組MVs作用48 h對HSFB活性氧含量的影響及各組MVs作用96 h對HSFB凋亡率的影響（ˉx±s，n=5）

圖2　成纖維細胞在不同時間點攝取正常成纖維細胞，UVA及UVB輻射后成纖維細胞誘導生成的MVs的熒光圖（激光共聚焦顯微鏡 ×200） 藍色為hoechest33342標記的細胞核，紅色為PKH26標記的MVs，細胞核周圍可見大量的MVs聚集，尤以紫外線輻射組為著

2.4細胞凋亡的檢測

2.4.1JC-1染色觀察線粒體膜電位的變化 線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）可快速靈敏檢測細胞的線粒體膜電位變化，用于早期的細胞凋亡檢測。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物（J-aggregates），可以產生紅色熒光?在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，可以產生綠色熒光。從而通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化，作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。對照組及加入未輻射組MVs組的細胞表現(xiàn)為紅色熒光，加入UVA及UVB輻射組MVs的HSFB表現(xiàn)為出現(xiàn)較多的細胞碎片，并出現(xiàn)較多綠色熒光，表明細胞出現(xiàn)早期凋亡。而兩組實驗組在加入抗氧化劑NAC后，細胞形態(tài)較完整，且產生紅色熒光為主（圖4）。

2.4.2流式細胞儀膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞凋亡 通過流式細胞儀定量檢測，加入UVA及UVB輻射組MVs的HSFB表現(xiàn)出凋亡率明顯升高，與對照組及未輻射組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而兩組實驗組在加入抗氧化劑NAC后凋亡率出現(xiàn)逆轉，與對照組及未輻射組對比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）見表1。

3　討論

紫外線誘發(fā)旁效應的機制仍不明確。近年來，學者提出氧化應激在紫外線輻射旁效應中的重要作用，研究者認為ROS、MDA等氧化產物均是小分子物質，可以在細胞內和細胞間擴散，從而導致旁觀者細胞的氧化損傷［7］。但是Mikula-Pietrasik等認為體內環(huán)境中存在一定的抗氧化物質，由紫外線輻射生成的多種氧化物質難以長期存在于細胞間隙，故亦難以發(fā)揮介導旁效應的功能［8］。研究表明，細胞可釋放MVs，其中包裹蛋白質，脂質及RNAs等信息分子，可避免在細胞間的運輸過程中多種酶類對MVs中信息物質的降解，從而實現(xiàn)細胞之間的信息交流及活性物質的轉移［9］。

圖3　各組MVs對HSFB活性氧含量的影響（熒光顯微鏡隨機拍攝 ×100）

圖4　各組MVs對HSFB線粒體膜電位的影響（熒光顯微鏡隨機拍攝 ×100）

MVs的釋放是一個高度保守的過程，其中所包含的信息物質依據(jù)其來源的不同而不同［10］。正常的細胞可分泌MVs，而受到損傷后的細胞，如腫瘤細胞，電離輻射后的細胞會分泌更多的MVs［11，12］。我們的研究也證明受到UVA及UVB急性損傷的細胞會分泌更多量的MVs，且輻射后細胞所分泌的MVs的大小發(fā)生變化，表明MVs的性質可能發(fā)生改變。為何損傷后的細胞會分泌更多的MVs，有研究表明缺氧狀態(tài)可促進MVs合成，可能與低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）信號通路的激活有關［11，13］。在紫外線急性損傷的細胞中是否存在該信號通路的激活，尚需進一步的研究。亦有研究表明細胞可通過出芽的方式分泌MVs，而損傷細胞產生更多的活性物質，細胞則通過出芽或內吞的方式產生更大量的囊泡以包裹和運輸信息物質［10］。

多種細胞均可攝取MVs，MVs可通過與受體細胞直接對接，與細胞膜融合或者通過細胞的胞吞作用進入胞內，一旦被細胞攝取，囊泡中的信息物質即被釋放［10］。本研究中提取的紫外線輻射的細胞所分泌的MVs，在加入受體細胞中，在30 min時即被受體細胞所攝取，隨時間推移細胞核周邊的MVs逐漸增多，呈現(xiàn)時間依賴性，MVs進入細胞后，并沒有被細胞器所降解，而是將其中的信息物質釋放出，介導了細胞間的信號交流。我們的研究顯示正常細胞分泌的MVs對細胞的生長及增殖沒有明顯影響，而輻射細胞分泌的MVs卻可誘導細胞的增殖率下降，氧化損傷的加劇及凋亡的發(fā)生。由此可知，MVs介導的信息傳遞很可能參與了紫外線誘導的旁效應的發(fā)生。

急性紫外線輻射后可造成直接受輻射細胞出現(xiàn)氧化損傷和細胞凋亡，已被廣泛驗證［14，15］。我們在前期的研究發(fā)現(xiàn)，收集輻射細胞的上清液培養(yǎng)正常的細胞，旁細胞中出現(xiàn)了氧化損傷及細胞的凋亡［4］，Widel等［2］采用共培養(yǎng)的方法，同樣在未直接受到輻射的細胞中發(fā)現(xiàn)了以上現(xiàn)象。但是有關上清液中何種物質介導了旁效應的發(fā)生，卻沒有進一步闡釋。本研究中我們僅提取了輻射細胞上清液中的MVs，發(fā)現(xiàn)同樣介導了旁觀者效應，說明了MVs介導的細胞間信息傳遞是導致旁效應的重要途徑之一。而此類的氧化損傷及凋亡可被抗氧化劑部分逆轉，說明氧化應激損傷在旁效應中有重要作用。以上研究結果揭示了紫外線輻射誘導的旁觀者效應中氧化應激的重要地位，損傷細胞釋放的MVs，其中包含有介導氧化損傷的信號分子，當MVs被受體細胞攝取后，信息物質即可釋放，引發(fā)受體細胞的生物學效應。

綜上所述，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)中長波紫外線可誘導成纖維細胞生成MVs，且紫外線誘導生成的MVs可以被受體細胞攝取，介導受體細胞的氧化損傷及凋亡。但是MVs中的何種物質以及通過何種分子機制途徑介導了紫外線的旁觀者效應尚需進一步的研究。

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（收稿：2015-09-02 修回：2015-09-28）

Effects of m icrovesicles on oxidative damage and apoptosis of fibroblasts induced by ultraviolet ir radiation

LIU Juan，ZHOU Bingrong，LUO Dan，ZHANG Jiaan，TAO Yanling，MIAO Yingying，XIE Shufen，F(xiàn)AN Zeng，YIFei，WU Hongjin，LIDan，WANG Shen.
Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

Corresponding authors：ZHOU Bingrong，E-mail：bingrong.2002@163.com

LUO Dan，E-mail：daniluo2013@njmu.edu.cn

Objective：To determine the effects ofmicrovesicles induced by UVA and UVB irradiation on oxidative damage and apoptosis skin fibroblasts.M ethods：Cultured skin fibroblastswere irradiated with UVA and UVB.Microvesicleswere extracted from supernatant of cultured fibroblasts.The size and the number of microvesicleswere detected by light scattering analysis technology.Themicrovesicles were co-incubated with normal fibroblasts.The active oxygen contentwas detected by reactive oxygen species（ROS）kit and apoptosis rate was detected by flow cytometry.Results：The size and themumber ofmicrovesicles abstracted from fibroblasts after UVA and UVB radiation was significantlymore than those in normal fibroblasts.The active oxygen content in fibroblasts irradiated by UVA and UVB and normal fibroblasts after co-incubated withm icrovesicles was（52.76±1.4347），（82.60±4.082）and（85.94±6.264），and the apoptosis rateswere（3.260±1.732）%，（28.94±2.430）%and（34.48±2.718）%.The cell oxidative damage and apoptosis rate can be reversed by the antioxidant.Conclusion：UVA/UVB radiation can induce skin fibroblasts to releasemicrovesicles，which can stimulate oxidative damage and apoptosis of the cells.

ultraviolet rays?fibroblasts?m icrovesicles?oxidative damage?apoptosis

國家自然科學基金（編號：81371757 81573072）

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南京，210029

周炳榮，E-mail：bingrong.2002@163.com

駱丹，E-mail：daniluo2013@njmu.edu.cn