徐漫遠(yuǎn)　孔迎輝　閔仲生

抗白靈霜在黑素合成中對(duì)TYR和MITF的調(diào)節(jié)作用

徐漫遠(yuǎn)1孔迎輝1閔仲生2

目的： 明確抗白靈霜（KBL）在黑素合成中對(duì)TYR和MITF的調(diào)節(jié)作用。方法： 體外培養(yǎng)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞，分為空白對(duì)照組和不同濃度KBL（5mg/mL，10mg/mL和15mg/mL）用NaOH溶解法檢測(cè)黑素合成量，Real time-PCR檢測(cè)TYR和MITF基因mRNA表達(dá)，Western Blot檢測(cè)KBL組TYR和MITF蛋白的表達(dá)。結(jié)果： 各濃度KBL組黑素合成量及TYR和MITF基因的mRNA和蛋白表達(dá)的水平均高于空白對(duì)照組，且呈濃度依賴性。結(jié)論： KBL可能通過(guò)上調(diào)MITF基因的表達(dá)，激活參與黑素合成的TYR以促黑素合成。

抗白靈霜? 小鼠B16黑素瘤細(xì)胞? 酪氨酸酶? 小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子? 黑素合成

白癜風(fēng)是一種進(jìn)行性色素脫失性疾病，是在多種因素共同作用下，表皮功能性黑素細(xì)胞（MC）發(fā)生破壞，皮膚出現(xiàn)白斑，中醫(yī)稱為“白駁風(fēng)”。白癜風(fēng)的發(fā)病與黑素合成有密切的關(guān)系。酪氨酸酶（TYR）和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）在黑素合成過(guò)程中有重要作用。黑素合成的速率與TYR的量和活性直接相關(guān)。在黑素細(xì)胞中，MITF可調(diào)控酪氨酸酶家族（TYR和TRP-l）的表達(dá)，從而參與黑素生成的調(diào)控，其主要是通過(guò)與酪氨酸酶家族啟動(dòng)子中的特殊部位結(jié)合（如M-Box），刺激啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性［1］。MITF是Rab27和Pmel17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Rab27和Pmel17對(duì)黑素小體的轉(zhuǎn)輸和其基質(zhì)的形成起重要作用［1，2］。

抗白靈霜（批準(zhǔn)文號(hào)是蘇藥制字Z04001778）是江蘇省中醫(yī)院皮膚科外用制劑，選用補(bǔ)骨脂、白芷、漢防己、烏梅、甘草等藥物組成。本試驗(yàn)探討抗白靈霜組分在黑素合成中對(duì)TYR、MITF的調(diào)節(jié)作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料

1.1細(xì)胞株小鼠B16黑素瘤細(xì)胞購(gòu)置中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2藥物均購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院，由江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部鑒定，制劑部制成抗白靈霜組分醇提浸膏。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將原配質(zhì)量濃度1 g/mL的醇提藥液配制成細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞所需的5、15、25 mg/mL，高溫滅菌后，置4℃冰箱中保存、備用。

1.3主要試劑DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）、小牛血清（上海普飛公司）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）、MTT、DMSO、TritonX-100（Sigm公司）、cDNA第一鏈合成試劑盒（KeyGen公司）、SYBR Green熒光定量試劑盒（TOYOBO公司）、一抗及內(nèi)參（β-Actin）（Ab-cam）、二抗（羊抗兔IgG-HRP）（Jckson）、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒（南京賽研生物技術(shù)有限公司）。

1.4儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、高速冷凍離心機(jī)（科俊儀器公司）、PCR儀（Bio-Red公司）、超低溫冰箱（SANYO）、紫外光度儀（SHIMADZU UV-2450）、PCR循環(huán)儀（Labnet MultiGene Gradient）、熒光定量PCR循環(huán)儀（中山達(dá)安DA7600）、凝膠成像儀（BIO-RAD）、Western電泳儀（Bio-Red公司）。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) B16細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液（10%FCS），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2NaOH溶解法檢測(cè)黑素含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素瘤細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每空5×104個(gè)，過(guò)夜，細(xì)胞貼壁，吸去培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的藥物（5、15、25 mg/m L），每個(gè)濃度做4個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，去上清，用PBS洗滌2次，每孔加500μL濃度為1mol/ L的NaOH，置在70℃水浴2 h以溶解黑素。將6孔板中的裂解液轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔100μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置酶標(biāo)儀400 nm處測(cè)黑素吸光值。黑素含量以藥物處理組A400/空白對(duì)照組A400×100來(lái)表示。

2.3Real time-PCR檢測(cè)TYR、MITF基因mRNA的表達(dá) 將B16黑素瘤細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜待其貼壁后，藥物組分別加入4 mL 10%FCS，1 mL各組藥液?空白對(duì)照組加入5mL 10% FCS，繼續(xù)孵育培養(yǎng)。24 h后，去上清，用Trizol、氯仿和異丙醇提取黑素細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄，最后行熒光定量PCR。實(shí)驗(yàn)步驟參照KeyGen公司cDNA第一鏈合成試劑盒及TOYOBO公司SYBR Green熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

引物設(shè)計(jì)：利用Primer Primer5軟件，分別依據(jù)人survivin及內(nèi)參GAPDH基因全序列，均由南京金斯瑞科技公司合成（表1）。

表1　引物序列

2.4Western blot檢測(cè)TYR、MITF蛋白的表達(dá) 將B16黑素瘤細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜待其貼壁后，藥物組分別加入4 m L 10% FCS，1 m L不同濃度的KBL組分醇提浸膏?空白對(duì)照組加入5mL 10%FCS，繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞的總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加熱變性后-20℃保存。取其總蛋白70μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF，封閉液封閉濾膜4 h，按約0.1 mL/cm2的量加入封閉液和適量一抗TYR（1∶500），兔抗大鼠β-actin（1∶5000）。搖床搖蕩孵育（4℃，過(guò)夜）。PBST漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔，二抗用封閉液稀釋）（1∶5000）室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。按0.1 mL/cm2顯影液計(jì)算用量，將顯影液加于NC膜上，室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好（盡量避免氣泡）。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機(jī)中顯影、洗像。調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，使用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（A-NOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異極顯著。

3　結(jié)果

3.1KBL組分促小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成 如表2所示，不同濃度的KBL組分醇提浸膏，與空白對(duì)照組相比，對(duì)黑素合成量均具有一定促進(jìn)作用（P< 0.05），呈濃度依賴性。

表2　KBL組分對(duì)黑素合成的影響

3.2KBL組分上調(diào)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞TYR基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平 不同濃度的KBL組分醇提浸膏與空白對(duì)照組相比，對(duì)TYR基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著提高（P<0.01），呈濃度依賴性。見表3和圖1。

表3　KBL組分對(duì)TYR基因的mRNA及蛋白水平變化（與內(nèi)參比值）

3.3KBL組分上調(diào)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞MITF基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平 不同濃度的KBL醇提浸膏與空白對(duì)照組相比，各藥物濃度組對(duì)TYR基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著提高（P<0.01），呈濃度依賴性。見表4和圖1。

表4　KBL組分對(duì)MITF基因的mRNA及蛋白水平變化（與內(nèi)參比值）

圖1　KBL組分對(duì)TYR、MITF相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4　討論

白癜風(fēng)是一種與遺傳和自身免疫性密切相關(guān)的常見皮膚病，一般認(rèn)為其病因?yàn)椋哼z傳因素，免疫損傷，氧化應(yīng)激機(jī)制，神經(jīng)體液，黑素細(xì)胞經(jīng)皮丟失學(xué)說(shuō)等。白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚未明確，從而缺乏有效的治療方案，臨床治療多為藥物治療（如：光敏性藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物、免疫制劑、維生素D3衍生物、抗氧化劑等），物理療法（如NB-UVB、定向高能中波紫外線、308 nm準(zhǔn)分子激光與準(zhǔn)分子激光等）及自體表皮與自體黑素細(xì)胞移植。此外，中醫(yī)藥治療白癜風(fēng)臨床療效確切，但許多藥物的具體作用機(jī)制尚不明確。

研究證明很多藥物都是通過(guò)增加TYR生物合成和對(duì)它的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行翻譯后的重新修飾等方式來(lái)發(fā)揮對(duì)黑素合成的調(diào)節(jié)作用［3］。簡(jiǎn)丹研究己烯雌酚對(duì)黑素合成的影響及其機(jī)制，觀察到不同濃度下己烯雌酚對(duì)TYR、MITF的mRNA轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)有上調(diào)作用?還探討己烯雌酚促黑素合成cAMPMITF-TYR途徑。Tuerxuntayi等［4］研究發(fā)現(xiàn)卡力孜然酊提取物通過(guò)上調(diào)TYR、MITF表達(dá)促小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成。Drira等［5］研究發(fā)現(xiàn)異野櫻素以濃度依賴方式促B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成?此外，作用24和48 h后，激活MITF并上調(diào)TYR、TRP1、TRP2。

KBL組方含有補(bǔ)骨脂、烏梅、白芷、漢防己、甘草等，具有祛風(fēng)和血，補(bǔ)益肝腎，潤(rùn)膚退白斑之效。補(bǔ)骨脂、烏梅均有提高機(jī)體免疫力及抗氧化的作用［6，7］。補(bǔ)骨脂及白芷具有光敏作用［6，8］，UVB照射后，可促進(jìn)黑素合成、黑素細(xì)胞分裂及遷移。漢防己甲素藥理研究顯示：具有調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、抑制炎癥反應(yīng)及擴(kuò)張局部血管、改善血液循環(huán)等作用［9］。甘草有增強(qiáng)機(jī)體免疫及抑制變態(tài)反應(yīng)等作用［10］。方中甘草、漢防己主要成份甘草酸與漢防己甲素有類似糖皮質(zhì)激素樣作用，可增強(qiáng)對(duì)黑素細(xì)胞的保護(hù)，抑制局部免疫反應(yīng)。

有研究表明人與小鼠在黑素細(xì)胞特異性基因（melanocyte-specific gene，MSG1）附近的基因序列并無(wú)很大差異［11］。MSG1基因?qū)ｉT調(diào)控MC的特異性表達(dá)，與MC的分化緊密聯(lián)系，且對(duì)調(diào)節(jié)黑素生成有重要作用。但B16黑素瘤細(xì)胞株存在老化和變性等問(wèn)題，其與正常人MC在生長(zhǎng)代謝方面有所不同，仍需尋求更為合適的模型。參考了相關(guān)文獻(xiàn)暫無(wú)明確的TYR激活藥物，未設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，從而缺乏抗白靈霜與其他藥物促黑素合成的比較。

PKA途徑是目前研究較多的影響黑素合成的重要信號(hào)通路之一。這一作用可能機(jī)制是由于PKA途徑被激活后，CREB磷酸化水平增高，修飾MITF的啟動(dòng)子而產(chǎn)生的?？蛇M(jìn)一步探討KBL組分促黑素合成是否通過(guò)該途徑發(fā)揮作用。氧化應(yīng)激機(jī)制為白癜風(fēng)病因之一，冗余的氧化應(yīng)激產(chǎn)物可破壞黑色細(xì)胞、抑制細(xì)胞內(nèi)黑素合成酶，影響黑素代謝及黑素細(xì)胞的存亡。KBL組分中補(bǔ)骨脂和烏梅現(xiàn)代藥理研究均具有抗氧化作用，接下來(lái)可以從該角度探討抗白靈霜組分治療白癜風(fēng)的可能作用機(jī)制。

在本研究中，我們觀察到KBL組分促小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成，并上調(diào)TYR、MITF基因的mRAN及相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。我們推測(cè)KBL組分可能通過(guò)MITF-TYR途徑發(fā)揮其促進(jìn)黑素合成的作用，其作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。中藥效用是多靶點(diǎn)的，今后可多方法多途徑研究中藥治療白癜風(fēng)的作用機(jī)理，為治療白癜風(fēng)提供更多的思路。

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（收稿：2016-01-20 修回：2016-02-15）

The regulative effect of Kang Bai Ling cream on TYR and MITF in melanogenesis

XU Manyuan，KONG Yinghui，MIN Zhongsheng.
1.Huai'an First People'sHospitalNanjing Medical University，Huai'an 223300，China?2.Province Hospitalof TCM Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM，Nanjing 210029，China

MIN Zhongsheng，E-mail：minzhsh@sina.com

Objective：To determine the regulative effect of Kang Bai Ling（KBL）creams on TYR and MITF in melanogenesis.M ethods：The cultured B-16 murine melanoma cells were divided into blank group and KBL groups with different concentration（5mg/mL，10 mg/mL and 15mg/mL）.The amount ofmelanin was detected by NaOH dissolvedmethod.The expression of TYR and MITFmRNA and protein was detected by real time-PCR and Western blot respectively.Results：The amount ofmelanin，the expressions of TYR and MITFmRNA and protein in KBL groupswere higher than those in blank group.The effectswere significant in a concentration dependentmanner.Conclusion：KBL can promotemelanogenesis through up-regulating the expression of MITF genes and activating TYR.

KBL?B16 murinemelanoma cells?tyrsionase?MITF?melanogenesis

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院，淮安，223300

2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院，南京，210029

閔仲生，E-mail：minzhsh@sina.com