鄭家三,張洪友,夏　成,徐　闖,王洪斌

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院,黑龍江大慶163319)

基于1H NMR技術(shù)的急性腐蹄病奶牛血清代謝組學(xué)分析

鄭家三1,2,張洪友2,夏成2,徐闖2,王洪斌1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院,黑龍江大慶163319)

通過1H核磁共振(1H NMR)技術(shù)結(jié)合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA),分別分析奶牛在患有急性腐蹄病時(shí)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化,研究腐蹄病的發(fā)生對奶牛代謝過程的影響,尋找差異表達(dá)的代謝物.運(yùn)用1H NMR技術(shù)獲得兩組奶牛血清代謝譜.所采集的數(shù)據(jù)經(jīng)過模式分析獲得差異代謝物.結(jié)果急性腐蹄病組與健康對照組相比,奶牛血清內(nèi)差異性代謝物為21個(gè).結(jié)果顯示,在奶牛發(fā)生腐蹄病時(shí)體內(nèi)糖類、氨基酸、脂類和能量代謝均發(fā)生了改變.表明結(jié)合1H NMR譜檢測分析的急性腐蹄病組對照組比對的差異代謝物,全景式地揭示了腐蹄病發(fā)生過程中奶牛機(jī)體內(nèi)發(fā)生了廣泛的代謝紊亂,為今后深入探究腐蹄病的發(fā)病機(jī)理和新的防治策略奠定了基礎(chǔ).

腐蹄病;代謝組學(xué);核磁共振波譜;多元統(tǒng)計(jì)分析

盡管在奶牛酮病、乳熱、脂肪肝和真胃變位等研究中均有利用代謝組學(xué)的1H NMR技術(shù)的相關(guān)報(bào)道,且關(guān)于腐蹄病奶牛血清的蛋白組學(xué)的多項(xiàng)檢測研究也有報(bào)道[1-2],但關(guān)于急性期奶牛腐蹄病的血清代謝組學(xué)的研究報(bào)道也尚未發(fā)現(xiàn).因此,本試驗(yàn)首次應(yīng)用1H NMR技術(shù)探討奶牛發(fā)生急性腐蹄病時(shí)的血清代謝組學(xué)的變化,為深入探究奶牛腐蹄病發(fā)生的新機(jī)制和尋求新的生物標(biāo)識物奠定了基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動物選擇和分組在黑龍江省暴發(fā)急性腐蹄病的某牧場進(jìn)行樣品采集,3～5歲且產(chǎn)2～ 3胎的經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛作為試驗(yàn)對象,其中10頭奶牛為急性腐蹄病組(F組),10頭奶牛為健康對照組(C組).試驗(yàn)組選取標(biāo)準(zhǔn):患病奶牛出現(xiàn)跛行,且呈急性經(jīng)過(病程為1～3 d),并通過PCR方法驗(yàn)證患蹄趾間棉拭子采樣樣品中有壞死桿菌白細(xì)胞毒素基因存在,從而確診奶?；加屑毙愿悴?本試驗(yàn)中兩組奶牛飼喂全混日糧,其日糧組成如本實(shí)驗(yàn)室另一研究中所示[6].清晨空腹采集奶牛尾靜脈血液樣本后,4℃下以3 000 r/min離心10 min.上清液貯存于-80℃檢測待用.

1.2樣品采集和血清1H NMR檢測1H NMR的血清代謝譜檢測:血清樣品4℃下以12 000 r/min離心10 min.每份樣品抽取200 μL上清液與150 μL磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)和150 μL三甲硅烷基丙磺酸鈉(TSP,1 mg/mL)混合后,經(jīng)12 000 r/min(4℃)離心10 min,取500 μL上清液轉(zhuǎn)移至5 mm核磁共振管.在280 k下,利用Bruker Avance 500 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀上記錄所有的1H NMR譜.

1.31H NMR數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析1H NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉變換后,導(dǎo)入TopSpin軟件(V3.0 BRUKER BIOSPIN,德國)中對所有譜圖信號基線校正并以TSP出峰位置定為δH 0.00[3].利用R(http://www. cran.r-project.org)軟件包將所有樣品光譜數(shù)據(jù)的積分區(qū)間設(shè)置為δ 0.4-8.0積分間距為δ 0.003,并去掉δ 4.2-8.0包含殘余的水峰.采用SIMCA-P+軟件(V13.0 Umetrics AB,于默奧,瑞典)進(jìn)行主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLSDA).利用Chenomx NMR Suite 7.5軟件(Chenomx Inc.,埃德蒙頓,加拿大),并結(jié)合以為文獻(xiàn)進(jìn)行代謝物歸屬.應(yīng)用SPSS軟件(SPSS,Inc.,芝加哥,美國)單因素方差分析對差異代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,整個(gè)研究過程中閾值P值設(shè)定為0.05.

2　結(jié)果

2.1兩組血清樣品的1H NMR譜圖1顯示了兩組具有代表性的血清樣品1H NMR.主要包括酮體、氨基酸物質(zhì)、有機(jī)酸、碳水化合物和脂蛋白等.之后通過多元統(tǒng)計(jì)分析對二組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析.圖中代謝物的數(shù)據(jù)列于表1.

2.2多元統(tǒng)計(jì)分析首先進(jìn)行的PCA分析(圖2a),獲得了兩個(gè)主成分(PC1與PC2),貢獻(xiàn)率分別為PC1=43.91%和PC2=14.49%,且R2X=0.79,Q2= 0.75.而后使用第一組分和第二正交組分構(gòu)建OPLS-DA模型.基于OPLS-DA,其得分圖(圖2b)中腐蹄病和對照組(C)比較得到R2X=79.1%,Q2=75.4.由圖2b可見,兩組沿t[1]已達(dá)到最大化的差異,說明奶牛腐蹄病組的血清代謝輪廓與對照組存在明顯差異.

圖1　通過1H NMR儀器檢測的獲得的腐蹄病組(F)和對照組(C)中具有代表性的樣品圖譜

圖2　(a)兩組的奶牛血清1H NMR數(shù)據(jù)的PCA得分圖;(b)兩組的奶牛血清1H-NMR數(shù)據(jù)的OPLS-DA得分圖腐蹄病組(F);方塊(■);對照組(C);三角形(▲)

OPLS-DA模型的血清載荷圖3a和3b(δ 0.4-2.5和δ 2.6-4.2)顯示了組間的代謝物變化,顯示不同組間差異代謝物上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)變化,該結(jié)果列于表1.通過對標(biāo)準(zhǔn)化的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),二組間中丙酮酸、肌氨酸、乳酸、琥珀酸和纈氨酸水平差異顯著(P<0.05).根據(jù)鑒定的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析,腐蹄病奶牛的代謝通路主要參與了氨基酸、糖和脂代謝中.圖中代謝物的數(shù)據(jù)列于表1.

3　討論

1H NMR技術(shù)已經(jīng)成為反芻動物疾病診斷和鑒定的強(qiáng)有力工具,利用該技術(shù)對奶牛酮病、乳熱和脂肪肝等疾病的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)[3-5].本試驗(yàn)中顯示在急性腐蹄病發(fā)生時(shí)奶牛體內(nèi)氨基酸、糖類和脂類等多個(gè)代謝通路發(fā)生了改變.

3.1氨基酸代謝異常甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸以及其代謝中間體(3-羥基異丁酸)是機(jī)體內(nèi)糖異生代謝途徑中主要的代謝產(chǎn)物[6].而由丙酮酸合成的丙氨酸,是機(jī)體內(nèi)肌肉組織中最重要的能量來源之一.以往研究中均報(bào)道過腐蹄病奶牛因蹄部疼痛而出現(xiàn)跛行和采食量下降等問題.但是在本試驗(yàn)中的腐蹄病奶牛呈現(xiàn)急性病程,疾病組奶牛并未出現(xiàn)采食量下降.基于此原因并結(jié)合1H NMR試驗(yàn)結(jié)果,證實(shí)糖異生底物的缺乏是奶牛突發(fā)腐蹄病的發(fā)病機(jī)制之一.

圖3　兩組的奶牛血清1H NMR數(shù)據(jù)(3a,δ 0.4-2.5;3b,δ 2.6-4.2)的OPLS-DA載荷圖

表1　三組間差異代謝物的表達(dá)變化

肌酸在機(jī)體內(nèi)具有重要的生物學(xué)作用,不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)的合成,也在尿素循環(huán)中參與代謝[7].腐蹄病組奶牛血清中肌酸含量的降低進(jìn)一步說明奶牛發(fā)生急性腐蹄病時(shí)機(jī)體內(nèi)能量利用增多.

以往的研究中指出1-甲基組氨酸與機(jī)體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激和能量蛋白的過度消耗具有密切的關(guān)系.而3-甲基組氨酸作為肌動蛋白和肌球蛋白甲基化的產(chǎn)物,是肌肉蛋白質(zhì)分解的代謝指標(biāo)[8].本試驗(yàn)中腐蹄病奶牛血清中1-甲基組氨酸和3-甲基組氨酸的變化,提示奶牛發(fā)生腐蹄病時(shí)膳食蛋白攝入出現(xiàn)不足.

3.2碳水化合物代謝異常本試驗(yàn)結(jié)果顯示,腐蹄病組奶牛的血清樣本中葡萄糖和丙酮酸含量與對照組相比均下降.葡萄糖通過糖酵解途徑產(chǎn)生ATP,也能在有氧條件下轉(zhuǎn)化為丙酮酸后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán).奶牛發(fā)生腐蹄病時(shí),機(jī)體內(nèi)因糖原分解、糖酵解和TCA循環(huán)發(fā)生改變,也導(dǎo)致ATP合成減少,因此機(jī)體內(nèi)通過增加乳酸水平而通過糖酵解增加ATP的產(chǎn)生[9].

作為磷酸甘油的衍生物,1,3-二磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸,2,3-二磷酸甘油酸和3-磷酸甘油酸,是糖酵解途徑中重要的代謝中間體[10].琥珀酸不僅能夠在呼吸鏈中傳遞電離子,也在TCA循環(huán)中具有重要作用.本試驗(yàn)中腐蹄病奶牛血清的甘油和琥珀酸含量較低,提示奶牛出現(xiàn)了糖代謝紊亂.

3.3脂代謝異常肉堿在脂肪酸代謝途徑中,促進(jìn)脂肪動員而進(jìn)一步為機(jī)體供能[11].但促進(jìn)脂肪酸代謝的同時(shí),也釋放出大量游離脂肪酸進(jìn)入血液和肝臟.而酮體(即乙酰乙酸、3-羥基丁酸和丙酮)是脂肪酸在肝臟進(jìn)行分解代謝的中間產(chǎn)物,若肝中合成酮體的量超過肝外組織利用酮體的能力,將導(dǎo)致體內(nèi)酮體含量增多.腐蹄病奶牛血清中肉堿水平的下降,提示奶牛發(fā)生腐蹄病時(shí)增強(qiáng)了脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體;而腐蹄病組血清中乙酰乙酸和丙酮含量的增多也進(jìn)一步說明機(jī)體內(nèi)脂肪酸合成的增強(qiáng).

4　結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用基于1H NMR檢測技術(shù)的代謝組學(xué)方法闡述奶牛急性腐蹄病的發(fā)病機(jī)理.急性腐蹄病奶牛與對照組奶牛血清代謝譜進(jìn)行比較,分析差異代謝物,揭示了腐蹄病與機(jī)體內(nèi)氨基酸代謝、糖代謝和脂代謝途徑的內(nèi)在聯(lián)系,并將差異代謝物與以往的研究進(jìn)行比較研究.

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Serum Metabolites in Dariy Cow with AcuteFootrot Using1H NMR based Metabonomics

ZHENG Jia-san1,2,ZHANG Hong-you2,XIA Cheng2,XU Chuang2,WANG Hong-bin1
(1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

Through the application of biological1H nuclear magnetic resonance(1H NMR)technique combined with the princi?pal component analysis(PCA)and orthogonal partial least-squares discriminant analysis(OPLS-DA),changes of endogenous me?tabolites of cows with acute footrot were analyzed to study the effects of footrot on cow metabolic process,and find the different me?tabolites.The serum metabolic profiles of the two groups were obtained by1H NMR.The collected data were analyzed with the mode analysis to get different metabolites.Compared with the healthy control group,21 different metabolites were obtained in foot?rot group.The cows with footrot had altered carbohydrate,amino acid,lipid,and energy metabolic pathways.The results show that1H NMR spectra combined with pattern recognition technique can effectively get the different metabolites of diagnosing footrot in cows,and reveal the widely metabolic disorder in cows in the process of footrot,which lays the foundation for the exploration of footrot mechanism in the future.

Footrot;Metabolomics;Nuclear Magnetic Resonance Spectrum

WANG Hong-bin

S852.5+3

A

0529-6005(2016)06-0007-03

2016-02-24

黑龍江省自然科學(xué)基金(C201229);"十二五"農(nóng)村領(lǐng)域國家科技課題(2012BAD12B05-2);國家科技支撐計(jì)劃(2013BAD21BO1)

鄭家三(1978-),男,副教授,博士生,從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究,E-mail:595095793@qq.com

王洪斌,E-mail:hbwang@ncau.edu.cn