陳亨利,莫金龍,康元環(huán),陳　龍,畢建飛,張冬星,李芳芳,李　影,單曉楓

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118)

藍(lán)曼龍魚(yú)致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

陳亨利,莫金龍,康元環(huán),陳龍,畢建飛,張冬星,李芳芳,李影,單曉楓

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118)

從患病藍(lán)曼龍魚(yú)(Trichogaster trichopterus)體內(nèi)分離到1株細(xì)菌CC0323,經(jīng)人工感染試驗(yàn)對(duì)藍(lán)曼龍魚(yú)有一定致病力.采用形態(tài)學(xué)觀(guān)察,生理生化鑒定,16S rRNA序列分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)等方法進(jìn)行鑒定.結(jié)果分離株CC0323為革蘭陰性短桿菌,具多形性,在RS瓊脂上可生長(zhǎng),呈中等大小,表面光滑的淡黃色濕潤(rùn)菌落;理化特性和藥敏試驗(yàn)結(jié)果與維氏氣單胞菌基本相同;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)CC0323與維氏氣單胞菌QXL0711B進(jìn)化關(guān)系最近.試驗(yàn)結(jié)果,證明分離株CC0323為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii).

藍(lán)曼龍魚(yú);維氏氣單胞菌;分離鑒定;16S rRNA;系統(tǒng)發(fā)育分析

藍(lán)曼龍魚(yú)(Trichogaster trichopterus),也稱(chēng)藍(lán)曼龍,屬鱸形目(Perciformes),攀鱸亞目(Anabantoi?dei),廣布于東南亞各國(guó)至太平洋熱帶及亞熱帶的淡水水域中,我國(guó)瀾滄江下游也有分布[1].其體型較扁,顏色艷麗,體側(cè)有幾塊形狀不規(guī)則的深藍(lán)色斑塊,腹部有兩條退化成長(zhǎng)絲狀的腹鰭,因這些與其他觀(guān)賞魚(yú)有著明顯不同的外觀(guān)特征而受到觀(guān)賞魚(yú)愛(ài)好者的喜愛(ài).

近年來(lái)隨著養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展,藍(lán)曼龍等熱帶淡水魚(yú)走進(jìn)了千家萬(wàn)戶(hù),對(duì)藍(lán)曼龍的研究也逐漸開(kāi)展.2015年3月,吉林長(zhǎng)春某觀(guān)賞魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)突發(fā)疾病,出現(xiàn)藍(lán)曼龍大量死亡病例.病死魚(yú)皮膚顏色變深,剖檢可見(jiàn)消化道黏膜出血,消化道內(nèi)有氣體.本試驗(yàn)對(duì)發(fā)病的藍(lán)曼龍魚(yú)進(jìn)行病原分離,得到一株致病菌,并對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定,16S rRNA序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),研究結(jié)果報(bào)告如下.

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料患病藍(lán)曼龍魚(yú)由長(zhǎng)春某觀(guān)賞魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)提供,健康藍(lán)曼龍魚(yú),購(gòu)自長(zhǎng)春某花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng).

1.2主要試劑RS瓊脂(購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司);微量生化反應(yīng)管(購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司);rTaq、pMD18T Vector及DNA Marker,購(gòu)自TaKaRa公司;Gel Extraction kit,購(gòu)自O(shè)mega公司.

1.3病原分離和細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察無(wú)菌操作取瀕死魚(yú)腸道、肝臟、心臟、血液等組織接種于RS瓊脂,于28℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng),保存于4℃?zhèn)溆?分離菌株于營(yíng)養(yǎng)瓊脂中劃線(xiàn),28℃培養(yǎng)24 h,觀(guān)察菌落形態(tài)、大小和顏色;挑取典型優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)行革蘭染色,鏡檢觀(guān)察細(xì)菌形態(tài).

1.4分離菌株人工感染試驗(yàn)及毒力測(cè)定將分離菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中,28℃振蕩培養(yǎng),菌落計(jì)數(shù)并用0.85%滅菌生理鹽水稀釋至2.82X108CFU/mL.將健康藍(lán)曼龍魚(yú)隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組8尾.試驗(yàn)組分別腹腔注射0.3 mL 2X108、2X107、2X106、2X105、2X104CFU/mL的菌懸液,對(duì)照組腹腔注射0.3 mL 0.85%滅菌生理鹽水.水體保持25℃并持續(xù)打氧.連續(xù)觀(guān)察14 d,對(duì)觀(guān)察期間死亡魚(yú)及時(shí)剖檢,觀(guān)察病理變化,分離病原,記錄病死魚(yú)并應(yīng)用改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量.

1.5生理生化鑒定挑取分離菌株單菌落接種至微量生化反應(yīng)管,28℃培養(yǎng)24 h結(jié)果判定以生化反應(yīng)管說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn).

1.6藥敏試驗(yàn)將分離菌懸液稀釋至1X106CFU/ mL,取100 μL均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,貼上卡那霉素等24種藥敏紙片,30℃溫箱培養(yǎng)20 h,觀(guān)察并記錄抑菌圈直徑,根據(jù)美國(guó)CLSI藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定.

1.716SrRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用熱裂解法制備模板,參照文獻(xiàn)[2]操作,引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,其序列為:上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物5′-AC?GGCTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收純化,將純化的片段連接pMD18T載體,送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序.測(cè)得的菌株16S rRNA序列經(jīng)NCBI的Blast進(jìn)行序列相似性比對(duì),用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析.

2　結(jié)果

2.1病原分離及形態(tài)學(xué)觀(guān)察病死魚(yú)體內(nèi)分離到1株致病菌,暫時(shí)命名為CC0323.該菌在RS瓊脂上呈圓形、邊緣整齊的黃色菌落;在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中呈圓形,邊緣整齊的半透明乳白色菌落.革蘭染色鏡檢可見(jiàn)分離株為革蘭陰性短桿菌,具多型性,常呈兩端鈍圓的短桿狀,散在或成對(duì)存在.

2.2人工感染試驗(yàn)及半數(shù)致死量測(cè)定接種菌株CC0323后,14 d內(nèi)試驗(yàn)組死亡情況如表1,其中大部分死亡發(fā)生在攻菌后24 h內(nèi).經(jīng)計(jì)算得分離菌株CC0323對(duì)藍(lán)曼龍魚(yú)的半數(shù)致死量為3.6X 106CFU/mL,平均致死時(shí)間為14 h.

表1　分離菌株CC0323半數(shù)致死量的測(cè)定

2.3發(fā)病癥狀與病理變化病魚(yú)初期游動(dòng)緩慢或停止游動(dòng),不喜食,死亡后體色變深;肛門(mén)周?chē)溲?腹部膨大、柔軟.剖檢可見(jiàn)腹內(nèi)有腹水流出,肝臟脆易碎,腸黏膜出血,腸內(nèi)脹氣,所有癥狀與自然病例相一致.

2.4生理生化結(jié)果分離菌株CC0323能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、β-半乳糖等,不發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖等,V-P試驗(yàn)呈陽(yáng)性,七葉苷、衛(wèi)矛醇、肌醇等呈陰性.具體的生化鑒定結(jié)果如表2,依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè),初步鑒定分離菌株CC0323為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii).

表2　分離菌株CC0323生化試驗(yàn)結(jié)果

2.5藥敏試驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株CC0323對(duì)氯霉素、磷霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等藥物敏感,對(duì)青霉素、多黏菌素B、氨芐西林及克林霉素表現(xiàn)耐藥.具體藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.

2.616SrRNA gene擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析經(jīng)16S rRNA gene PCR擴(kuò)增得到一段約1 500 bp大小的片段(圖1),經(jīng)測(cè)序片段大小為1 560 bp.

將測(cè)序得到的序列經(jīng)NCBI上的Blast檢索比對(duì),發(fā)現(xiàn)分離菌株16S rRNA gene序列與維氏氣單胞菌QXL0711B(登錄號(hào)FJ808727.1)的相應(yīng)序列同源性達(dá)到99%.應(yīng)用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2),可見(jiàn)分離菌株CC0323與維氏氣單胞菌處于同一進(jìn)化分支.

表3　藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

圖1　分離菌株CC0323 16S rRNA gene擴(kuò)增結(jié)果

3　討論

本研究從患病的藍(lán)曼龍魚(yú)體內(nèi)分離到一株致病菌,生理生化鑒定、生物信息學(xué)分析確定分離菌株CC0323為維氏氣單胞菌.經(jīng)革蘭染色鏡下可見(jiàn)分離菌株為革蘭陰性短桿菌,常散在或成對(duì)存在,觀(guān)察到此菌具有多形性,大多為短桿狀,部分呈絲狀.細(xì)菌多形性的產(chǎn)生一方面是由于環(huán)境條件而造成的,另一方面,某些細(xì)菌,如恥垢分支桿菌,其生活史中必定存在多形性[3].在本實(shí)驗(yàn)室的以往實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)條件下,多株不同動(dòng)物源的維氏氣單胞菌菌體均存在多形性[4],或許能夠表明維氏氣單胞菌的生活史中同樣存在多形性這一特殊過(guò)程,具體在生活史上的哪一階段還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明.

圖2　基于不同氣單胞菌屬菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

傳統(tǒng)的生理生化、藥敏試驗(yàn)鑒定和形態(tài)學(xué)觀(guān)察只能大致確定菌株的革蘭染色特性和分屬,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,16S rRNA gene序列越來(lái)越多的應(yīng)用于細(xì)菌鑒定.在生物的進(jìn)化過(guò)程中,16S rRNA gene序列變化十分緩慢,并且在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守性,可用于分析生物的進(jìn)化和親緣關(guān)系[5],因此可以用于菌株的鑒定分析.應(yīng)用不同氣單胞菌屬菌株16S rRNA gene序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),可見(jiàn)分離維氏氣單胞菌CC0323與維氏氣單胞菌QXL0711B進(jìn)化關(guān)系最相近,并與其他維氏氣單胞菌菌株同屬一支.綜合生理生化鑒定和生物信息學(xué)分析,可確定分離到的菌株為維氏氣單胞菌.

維氏氣單胞菌是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種病原菌,廣泛存在于水體環(huán)境中,該菌可引起多種經(jīng)濟(jì)魚(yú)和觀(guān)賞魚(yú)發(fā)生疾病,通常表現(xiàn)為病死魚(yú)出現(xiàn)腹水及消化道潰瘍、出血[6-10],也可引起人類(lèi)的腹瀉甚至敗血癥[11-13].經(jīng)過(guò)對(duì)藍(lán)曼龍魚(yú)的半數(shù)致死量測(cè)定,可知維氏氣單胞菌CC0323在濃度低時(shí)對(duì)藍(lán)曼龍魚(yú)致病性較弱,但當(dāng)菌濃度達(dá)到一定程度,會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)造成藍(lán)曼龍魚(yú)的大量死亡.因此在養(yǎng)殖過(guò)程中,應(yīng)密切注意水體中致病微生物,定期做好消毒措施,控制養(yǎng)殖密度,保證水體清潔,防止致病微生物大量增殖,以消除致病菌造成的疾病隱患.

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Isolation,identification and phylogenetic analysis of pathogenic Aeromonas veroniifromTrichogaster trichopterus

CHEN Heng-li,MO Jin-long,KANG Yuan-huan,CHEN Long,BI Jian-fei,ZHANG Dong-xing,LI Fang-fang,LI Ying,SHAN Xiao-feng
(College of animal science and technology,jilin agricultural university,changchun 130118,China)

A bacterial strain CC0323 was isolated from Trichogaster trichopterus,which had definite virulence to the fish after artificial infection.Morphology,physical and chemical characters,and 16S rRNA sequence analysis were used for identification. The results showed that strain CC0323 was gram negative.The isolate was pleomorphic,which could grow in RS agar and show a median,smooth surface,and yellow bacterial colony.The physical and chemical characters and the results of drug sensitivity test were identical with Aeromonas veronii.The phylogenetic analysis between strain CC0323 and A.veronii QXL0711B showed related homology.The results demonstrated that the isolate CC0323 was Aeromonas veronii.

Trichogaster trichopterus;Aeromonas veronii;isolation and identification;16S rRNA;phylogenetic analysis

s:SHAN Xiao-feng;LI Ying

S941.42

A

0529-6005(2016)06-0115-04

2015-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201927);吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204065NY)

陳亨利(1991-),男,碩士生,從事動(dòng)物微生物學(xué)研究,E-mail:chl9108@163.com

單曉楓,E-mail:sxf1997@163.com;李影,E-mail: thliying@163.com