沈付嬈,楊建樂,趙貴民,朱　彤,程凱慧,王洪梅,何洪彬

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心,山東濟南250100;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟南250000;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

牛冠狀病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

沈付嬈1,2,楊建樂1,3,趙貴民1,朱彤1,程凱慧1,王洪梅1,何洪彬1

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心,山東濟南250100;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟南250000;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

針對牛冠狀病毒(BCoV)N基因保守序列設(shè)計合成了1對特異性引物,以體外轉(zhuǎn)錄法制備的cDNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板,建立了檢測BCoV的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法.在1個反應(yīng)體系中模板最低檢測限為7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加靈敏;與牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均無交叉反應(yīng);批內(nèi)、批間重復(fù)變異系數(shù)均低于1.5%;應(yīng)用定量PCR檢測了39份疑似臨床病料,陽性檢出率為51.28%(20/39),普通RT-PCR為41.03%(16/39).結(jié)果表明,該方法特異性強、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確率高,本方法將為BCoV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障.

牛冠狀病毒;SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR;病毒核酸檢測

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬2a亞群,為單股正鏈RNA病毒[1].由于病毒核衣殼蛋白N基因高度保守,常被用于BCoV的檢測[2].BCoV是引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原[1].自1972年Mebus首次報道分離到BCoV[3],全世界很多國家和地區(qū)先后報道了BCoV的感染情況[4]. BCoV主要通過消化道和呼吸道傳播,感染的牛長期帶毒并在一定時期內(nèi)持續(xù)排毒,易造成牛群的大范圍感染[5].因此,對帶毒牛的及時檢出和牛場環(huán)境監(jiān)測就顯得尤為重要.

實時熒光定量PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程的核酸定性、定量分析技術(shù),具有敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動化程度高、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點[6],已成為病原微生物快速檢測的重要方法.本研究針對BCoV高度保守的N基因序列設(shè)計引物,建立了BCoV SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法,并初步應(yīng)用于臨床樣本的檢測.

1　材料與方法

1.1試驗材料與試劑反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒,均購自寶生物工程(大連)有限公司.39份腹瀉糞便樣本采自多個規(guī)?；龅某赡概?

1.2引物的設(shè)計及陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備根據(jù)BCoV Mebus株(GenBank:U00735.2)N基因的保守區(qū),利用Primer Express 3.0設(shè)計合成了3對引物,最終篩選出最佳引物對,即上游引物(P1):5′-TC?GTTCTGGTAATGGCATCCT-3′;下游引物(P2): 5′-AGTAGCAGTTTGCTTGGGTTGAG-3′,目的片段為100 bp.以BCoV的cDNA為模板進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠回收后克隆至pEAST-T3載體,重組陽性質(zhì)粒送上海華大基因科技服務(wù)有限公司測序,結(jié)果正確的重組質(zhì)粒用核酸蛋白分析儀測得濃度為265 ng/μL.按照下面的公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù):拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度X10-9X6.02X1023/ (660X質(zhì)粒總長度),計算出所獲質(zhì)粒的拷貝數(shù)為7.8X1010copies/μL.

1.3SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR擴增,其反應(yīng)總體系為20 μL.設(shè)立引物終濃度梯度為0.1～1.0 mol/L,溫度梯度為59℃～68℃,根據(jù)PCR擴增結(jié)果,以Ct最小值、熒光最高值、熔解曲線顯示只有單特異峰為標(biāo)準(zhǔn),對退火溫度、引物濃度、循環(huán)條件進行優(yōu)化.

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性、特異性和重復(fù)性試驗以不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,采用優(yōu)化好的條件進行熒光定量PCR擴增,得到各自的Ct值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.并比較熒光定量PCR和普通RT-PCR的敏感性.以BCoV、BRV、BVDV、IBRV、BEV、BEFV和BPIV3病毒的cDNA/DNA為模板(均為本實驗室保存),驗證本方法的特異性;用 DNA含量為7.8X103～7.8X106copies/μL的模板分別做3個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù),評價其重復(fù)性.

1.5臨床樣品的檢測用本研究建立的熒光定量PCR方法和RT-PCR分別對39份送檢樣本進行檢測,將檢測結(jié)果陽性的PCR產(chǎn)物送上海華大基因科技服務(wù)有限公司測序進行確認,最后對兩種檢測結(jié)果進行比較.

2　結(jié)果

2.1實時熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL:2X SYBR Premix Ex Taq II 10 μL,模板2 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 7 μL.反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s,95℃變性5 s、60℃退火延伸30 s,進行40個循環(huán);熔解曲線為95℃5 s、62℃60 s、95℃Continuous;最后50℃30 s,結(jié)束反應(yīng).溫度轉(zhuǎn)換率為20℃/s,在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進行熒光信號檢測.實時熒光定量PCR檢測BCoV的擴增曲線見圖1.

圖1　SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的擴增曲線

2.2實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以起始模板濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),以循環(huán)中的Ct值為縱坐標(biāo),建立熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),標(biāo)準(zhǔn)曲線的表達式為y=-3.2966x+38.697,相關(guān)系數(shù)R2值為0.9777,說明該方法線性關(guān)系良好.通過對熔解曲線分析(圖3),可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品均出現(xiàn)了窄且尖的單峰,而陰性對照沒有出現(xiàn)熔點峰.表明該SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應(yīng)為特異性擴增.份為BCoV感染陽性,陽性檢出率為41.03%.所有陽性樣本均通過PCR產(chǎn)物序列測定驗證,結(jié)果證實為BCoV感染陽性.

圖2　SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR溶解曲線

2.3特異性和敏感性試驗用建立的熒光定量PCR方法對BCoV、BEV、BEFV、BVDV、IBRV、BRV和BPIV3進行檢測,結(jié)果只是BCoV有熒光曲線(圖4).經(jīng)過檢測,確定實時熒光定量PCR在20

圖4　SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR特異性擴增曲線

表1　SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的重復(fù)性試驗

3　討論

目前BCoV的核酸檢測被認為是一個較敏感和快速的診斷方法[7],先后有RT-PCR、Nested PCR、Semi-Nested PCR的研究報道[8-9].Nicola Decaro等應(yīng)用TaqMan探針建立了BCoV熒光定量RT-PCR方法[10],相比較普通的RT-PCR,更加特異、靈敏,但是存在探針設(shè)計復(fù)雜、淬滅不徹底、成本高等不足.本研究以價格低廉的SYBR GreenⅠ染料代替探針,μL反應(yīng)體系中的最低檢出限為7.8 copies/μL (7.8X101copies/μLX2 μL/20 μL),而普通RT-PCR為7.8X102copies/μL(圖5).表明SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR要比普通PCR有更高的敏感性.

圖5　普通RT-PCR的敏感性檢測

2.4重復(fù)性試驗以4份不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,分別做批內(nèi)、批間重復(fù),通過計算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)來驗證熒光定量PCR的重復(fù)性.變異系數(shù)均小于1.5%,重復(fù)性良好,見表1.

2.5臨床檢測結(jié)果通過對39份臨床樣品進行檢測,熒光定量PCR檢測出20份BCoV感染陽性,陽性檢出率為51.28%,而普通RT-PCR僅檢出16建立了SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法,可以用于牛冠狀病毒病的實驗室早期診斷.

BCoV引起的犢牛感染多為1～90日齡,腹瀉常發(fā)生于1～2周齡內(nèi),這一時期犢牛血清抗體反映的是從初乳中獲得的母源抗體水平.用普通RT-PCR和熒光定量PCR方法檢測病毒核酸,不受母源抗體的影響.在對39份臨床樣品的檢測中,SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測到20份陽性,而普通RT-PCR檢測到16份陽性,說明該熒光定量方法相對于普通RT-PCR方法的陽性檢出率提高了10.25%.這證明熒光定量PCR比普通RT-PCR更敏感.

總之,本研究建立的牛冠狀病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法特異、敏感、穩(wěn)定、高效.每次反應(yīng)96個樣本可同時進行,試驗結(jié)束后不需要凝膠電泳,從樣本處理到報告結(jié)果得出僅需3 h.可以滿足對大規(guī)模暴發(fā)的疫情做出快速準(zhǔn)確的診斷.這對于下一步開展BCoV流行病學(xué)調(diào)查、臨床病例的快速診斷乃至疫病的防控等方面會起到重要作用.

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Development and preliminary application of a SYBR GreenⅠReal-timePCR assay for detection of bovinecoronavirus

SHEN Fu-rao1,2,YANG Jian-le1,3,ZHAO Gui-min1,ZHU Tong1,CHENG Kai-hui1,WANG Hong-mei1,HE Hong-bin1
(1.Research Center of Dairy Cattle,Shandong Academy of Agricultural Science,Jinan 250100,China;2.College of Life Science,Shandong Normal University,Jinan 250000,China;3.Northeast Agricultural University college of life science,Harbin 150030,China)

In order to detect bovine coronavirus(BCoV),we developed a SYBR GreenⅠreal-time PCR assay.According to the sequence of bovine coronavirus N gene,a pair of primers was designed.The cDNA was prepared by in vitro transcription and used as standard positive template.Then,the SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative RT-PCR assay was established to detect BCoV.The developed SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative RT-PCR was much more sensitive than the conven?tional RT-PCR and could detect the template as low as 7.8 copies/μL.There were no cross reactions with the other digestive and respiratory pathogens from cattle.The Inter-and intra-assays were conducted using the standard plasmid and the coefficients of variation were less than 1.5%.The 39 suspected samples were detected both by SYBR GreenⅠreal-time RT-PCR,and gel-based RT-PCR,and the positive detection rate were 51.28%and 41.03%,respectively.The SYBR GreenⅠreal-time PCR assay was much more specific,sensitive,rapid and accurate and could be used as an effective tool for clinical diagnosis,epidemiological in?vestigation and quantification of bovine coronavirus.

BCoV;SYBR Green I Real-time PCR;Virus Detection

HE Hong-bin

S852.65+3

A

0529-6005(2016)06-0022-03

2014-12-31

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系科學(xué)家崗位(Cars-37);泰山學(xué)者海外特聘專家(tshw20100417);國家自然科學(xué)基金(31272586;31302095);山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題,獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室開放課題基金(SKLVBF201510);山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點項目(2014CXZ08)子課題(2014CXZ-08-3);山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大成果培育項目(2015CGPY02)

沈付嬈(1989-),女,碩士生,從事免疫細胞生物學(xué)研究,E-mail:FuraoS@126.com

何洪彬,E-mail:hongbinh@hotmail