王 穎， 任志瑩， 陳芳芳

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(沈陽(yáng))，遼寧沈陽(yáng) 110161)

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利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速檢測(cè)玉米籽粒中轉(zhuǎn)基因成分

王 穎， 任志瑩， 陳芳芳

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(沈陽(yáng))，遼寧沈陽(yáng) 110161)

[目的]利用TaqMan特異性熒光標(biāo)記法快速檢測(cè)玉米籽粒中轉(zhuǎn)基因成分。[方法]外源基因選取具有一定代表性的CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、BAR、CryIA(b)基因，數(shù)據(jù)結(jié)果由實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的Ct值判定。[結(jié)果]用該方法檢測(cè)玉米籽粒中未含有轉(zhuǎn)基因成分，可作為結(jié)果判定。[結(jié)論]該方法在樣品量大時(shí)極具優(yōu)勢(shì)，高效，準(zhǔn)確，對(duì)環(huán)境污染較小。

轉(zhuǎn)基因玉米；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；特異性；外源基因

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展以及轉(zhuǎn)基因生物的大面積推廣，在關(guān)注轉(zhuǎn)基因生物所帶來(lái)的巨大社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全性問(wèn)題也引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境是否會(huì)帶來(lái)潛在不良影響，已引起人們的普遍關(guān)注。加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品安全性監(jiān)管，對(duì)保護(hù)和促進(jìn)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易和我國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[1]。因此，轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度相繼建立，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)也提出了嚴(yán)格的要求，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)也成為研究熱點(diǎn)。PCR檢測(cè)具有高靈敏度、高特異性和高效性的特點(diǎn)，是目前檢測(cè)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和食品中轉(zhuǎn)基因成分最為成熟和廣泛應(yīng)用的方法。

PCR儀檢測(cè)方法有普通PCR熒光定性方法和實(shí)時(shí)熒光定量方法2種。前者提取待測(cè)樣品DNA后經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、制膠、電泳，再由凝膠像儀觀察電泳后膠板中DNA條帶情況。此法可判斷待測(cè)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。影響結(jié)果正常表達(dá)的因素有很多： DNA濃度、電泳電壓、跑膠時(shí)間、膠板厚度、氣溶膠、人為判斷誤差等；后者提取待測(cè)樣品DNA后無(wú)需經(jīng)過(guò)電泳及凝膠成像步驟，直接擴(kuò)增，由PCR儀熒光檢測(cè)器捕獲信號(hào)。常用2種熒光標(biāo)記方法：SYBR Green非特異性熒光標(biāo)記法和TaqMan特異性熒光標(biāo)記法[2]。SYBR Green非特異性熒光標(biāo)記法雖然操作方便，但反應(yīng)時(shí)易產(chǎn)生假陽(yáng)性，影響結(jié)果判斷。筆者利用TaqMan特異性熒光標(biāo)記法快速檢測(cè)玉米籽粒中是否存在轉(zhuǎn)基因成分。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料選取玉米籽粒陰性對(duì)照樣品一份，轉(zhuǎn)基因玉米Bt11陽(yáng)性樣品一份，待測(cè)玉米籽粒樣品一份。

1.2試劑及儀器植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技公司；Premix EXTaq,大連寶生物工程有限公司；iTaqUniversal Probes Supermix,BIO-RAD公司；引物及探針，Invitrogen沈陽(yáng)匯佰生物科技公司合成；BIO-RAD IQ5定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；NanoDrop2000型DNA定量?jī)x，美國(guó)Thermostat公司；臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；生物安全柜，蘇州凈化設(shè)備有限公司[3]。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1DNA提取。將待測(cè)玉米籽粒在無(wú)菌條件下研磨，充分混勻樣品，按四分法各取樣品0.1～0.2 mg，分裝至3個(gè)離心管中，采用試劑盒提取DNA，制備成待測(cè)樣品DNA溶液。將玉米陰性樣品、玉米陽(yáng)性樣品及待測(cè)樣品檢測(cè)濃度后待用[4-5]。

1.3.2擴(kuò)增體系制備[2]。擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。對(duì)玉米樣品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，參數(shù)可選擇CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、BAR、CryIA(b)基因。結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行鑒定。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系

Table 1Amplification system of real-time fluorescent quantitative PCR

試劑名稱Reagentname終濃度Finalconce-ntration體積Reaction∥uLiTaqTMUniversalProbesSrpermix1×25.00引物RPrimerR(10umol/L)150nmol/L0.75引物FPrimerF(10umol/L)150nmol/L0.75探針Probe(5umol/L)50nmol/L0.50DNA模板DNAtemplate(40～50ng/uL)—4.00補(bǔ)水至Watersupplement—50.00

1.3.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，40個(gè)循環(huán)[6]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增所用引物和探針見(jiàn)表2。

表2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增所用引物和探針

Table 2Primers and probes for real-time fluorescent quantitative PCR amplification

待測(cè)基因Detectedgene引物、探針序列Sequencesofprimersandprobes擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Lengthofamplifiedfragments∥bpZEIN5'-TGAACCCATGCATGCAGT-3'—5'-GGCAAGACCATTGGTGA-3'5'-FAM-TGGCGTGTCCGTCCCTGATGC-3'CaMV35S5'-CGACAGTGGTCCCAAAGA-3'745'-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3'5'-FAM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-3'NOS5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'1655'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'5'-FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-3'BAR5'-ACAAGCACGGTCAACACC-3'—5'-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3'5'-FAM-CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG-3'CryIA(b)5'-GGGAAATGCGTATTCAATTCAAC-3'735'-TTCTGGACTGCGAACAATGG-3'5'-FAM-ACATGAACAGCGCCTTGACCACAGC-3'

2　結(jié)果與分析

2.1DNA提取質(zhì)量DNA溶液經(jīng)DNA定量?jī)x測(cè)定，提取的DNA完整性很好，OD260/OD280均在1.8～1.9，符合定量PCR檢測(cè)要求。

2.2實(shí)時(shí)滎光定量PCR結(jié)果待測(cè)樣品、玉米陰性對(duì)照樣品和玉米陽(yáng)性對(duì)照樣品每個(gè)參數(shù)共2個(gè)平行反應(yīng)，同時(shí)做空白對(duì)照，即03～04空白對(duì)照，05～06陰性對(duì)照，07～08待檢樣品，09～10陽(yáng)性對(duì)照。共選取內(nèi)標(biāo)基因及外源基因5組參數(shù)：B行篩選CaMV35S基因，C行篩選NOS基因，D行篩選BAR基因，E行篩選CryIA(b)基因，F(xiàn)行內(nèi)標(biāo)基因。由每組參數(shù)Ct值可以判定，該試驗(yàn)結(jié)果有效：外源基因組Ct值大于或等于40，內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值小于或等于24，判定此樣本未檢出該外源基因。外源基因組Ct值小于或等于36，內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值小于或等于24，判定此樣本檢出該外源基因。

由表3可知，陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品及待測(cè)樣品內(nèi)標(biāo)基因Ct值均小于等于24，為玉米樣品；待測(cè)樣品檢測(cè)其余篩選的外源基因均未檢測(cè)到。由此可知，該玉米籽粒中未含有轉(zhuǎn)基因成分，可作為結(jié)果判定。

表3　PCR定量檢測(cè)結(jié)果

3　討論

該研究利用TaqMan特異性熒光標(biāo)記法快速檢測(cè)玉米籽粒中轉(zhuǎn)基因成分，可達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測(cè)大量樣品的目的，無(wú)需配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可做定性分析。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR均采用外標(biāo)定量，需要已知濃度的檢測(cè)物作為參照樣品，參照標(biāo)準(zhǔn)品的制備費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高。當(dāng)無(wú)需被測(cè)樣品轉(zhuǎn)基因成分含量只需定性分析時(shí)，用普通PCR儀后期工作量大，在環(huán)境中易形成氣溶膠，造成二次污染，影響結(jié)果正常分析。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)可避免對(duì)環(huán)境及人體造成危害，環(huán)保高效，為人所用。

[1] 郭金超,付仲文,于晴,等.對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)及安全管理的思考[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(25):333-336.

[2] 宋君，雷紹榮，劉勇，等.轉(zhuǎn)基因玉米MON863 品系特異定量PCR 方法的建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011, 50(24): 5250-5253.

[3] 袁磊,紅煒,李凡.以實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON88017[J].作物學(xué)報(bào),2011, 37(11): 2117-2121.

[4] 中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫總局.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 核酸定性PCR 檢測(cè)方法:GB/T19495．4—2004[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[5] 中華人民共和國(guó)山東出入境檢驗(yàn)檢疫總局.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定量PCR 檢測(cè)方法:GB/T19495．5—2004[S]．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[6] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法:SN/T 1196-2012[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

Quickly Detection of Transgenic Ingredients in Corn Grain by Real-time Fluorescent PCR Technology

WANG Ying, REN Zhi-ying, CHEN Fang-fang

(Agricultural Products Quality Supervision, Inspection and Test Center (Shenyang) of the Ministry of Agriculture, Shenyang, Liaoning 110161)

[Objective] To rapidly detect the transgenic ingredients in corn grain by TaqMan specificity fluorescent tags. [Method] CaMV35S promoters and NOS terminator, BAR, CryIA(b) gene with certain representativeness were selected as exogenous genes. Data results were judged by Ct value of real-time fluorescent quantitative PCR reaction. [Result] corn grain without transgenic ingredients detected by this method could be used as the judgement result. [Conclusion] This method is of most advantage under large sample amount. It is efficient and accurate, and has less pollution to the environment.

Transgenic corn; Real-time fluorescent quantitative PCR; Specificity; Exogenous gene

農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心項(xiàng)目。

王穎(1974- )，女，遼寧沈陽(yáng)人，助理研究員，從事農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法比較研究。

2016-05-26

S 513

A

0517-6611(2016)20-112-02