關(guān)曉燕　吳垠　毛東東　姜冰　董穎　王召會(huì)　胡超魁

摘要：從遼東灣沿岸受石油污染的沉積物中篩選得到一株石油降解菌株BHB—16，對該菌進(jìn)行了形態(tài)以及16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定該菌株為Lutibacterium菌屬。應(yīng)用沸石和珊瑚石作為載體進(jìn)行該菌株的固定化研究，確定當(dāng)沸石作為載體時(shí)，固定化的最佳條件為：菌株接種量為0.6 mL，培養(yǎng)時(shí)間28 h，載體投加量為10 mL；選用珊瑚石為載體時(shí)，固定化的最佳條件為：菌株接種量為0.6 mL，培養(yǎng)時(shí)間29 h，載體投加量為12 mL；此外，用沸石和珊瑚石固定后的菌株，其對于柴油的降解率相對于游離菌分別提高了14.4%和29.6%，初步選用珊瑚石作為載體進(jìn)行菌株的固定化使其具有更好的石油降解能力。

關(guān)鍵詞：石油降解菌；固定化；沸石；珊瑚石

海洋石油的開采，石油加工產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用以及排放，海上溢油污染事故等，使得石油已然成為海洋環(huán)境的主要污染物質(zhì)之一。每年通過各種渠道泄入海洋的石油和石油產(chǎn)品，約占全世界石油總產(chǎn)量的0.5 %，傾注到海洋的石油量達(dá)200萬～1000萬t。2010—2012年先后發(fā)生的墨西哥灣鉆井平臺(tái)漏油事故、大連新港儲(chǔ)油碼頭輸油管道爆炸事故以及蓬萊19—3油田溢油污染事故給海洋生態(tài)環(huán)境造成了災(zāi)難性的損害，同時(shí)也對沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失，因此，近年來，海洋石油污染的有效修復(fù)成為了時(shí)下的熱點(diǎn)研究問題。

生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、無二次污染、處理效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而現(xiàn)今被廣泛應(yīng)用于海洋污染修復(fù)過程中。該技術(shù)主要依賴于自然界中微生物對污染物的生物代謝作用，而由于自然環(huán)境的復(fù)雜性以及不同石油污染對象的特異性，使得直接投加外源高效降解菌在自然環(huán)境下的石油污染修復(fù)中往往難以達(dá)到預(yù)期效果。固定化技術(shù)是對完整的微生物細(xì)胞進(jìn)行固定，可以避免人為破壞生物酶的活性和生化反應(yīng)的穩(wěn)定性，提高單位體積載體中微生物細(xì)胞密度，固定化后的微生物能夠長期保持活性，使其在具備抵抗外界復(fù)雜環(huán)境中能力，穩(wěn)定地發(fā)揮高效能，將微生物固定化技術(shù)應(yīng)用于石油污染的生物治理有著極大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。

本研究以遼東灣地區(qū)受污染的環(huán)境中分離得到一株對石油烴具有降解能力的菌株BHB—16，對其進(jìn)行16s rDNA菌種鑒定，并選取沸石和珊瑚石作為吸附載體進(jìn)行菌株的固定化研究，考察固定化菌對石油烴的降解能力，為遼東灣區(qū)域海洋石油污染的生物修復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種來源 從遼東灣附近的受污染沉積物中分離并篩選獲得。

1.1.2試劑和培養(yǎng)基 菌株篩選分離培養(yǎng)基：添加0.2%0#柴油的2216E瓊脂培養(yǎng)基，其中2216E瓊脂培養(yǎng)基購置于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

石油降解菌富集培養(yǎng)基：2216E液體培養(yǎng)基，購置于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

沸石和珊瑚石載體購置于大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1石油降解菌的篩選 取10 g沉積物樣品，加入裝有100 mL滅菌后的海水和0.2%（v：v）的0#柴油的三角瓶中，28℃、150 r/rain搖床震蕩培養(yǎng)20 d，期間補(bǔ)充0#柴油二次，0#柴油加入量同樣為0.2%。將馴化后的沉積物樣品經(jīng)充分分散后作梯度稀釋，在篩選分離培養(yǎng)基上進(jìn)行均勻涂布，28℃培養(yǎng)5 d，挑取單菌落，在2216E瓊脂培養(yǎng)基中劃線，分離純化，得到單一菌株。

1.2.2石油降解菌16S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析應(yīng)用TAKARA MiniBEST Bacterial GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0對篩選到的石油降解菌BHB—16進(jìn)行基因組DNA提取。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，引物序列為27F：5一AGAGTTTGATCCTGCK；TCAG—3和1492R：5一GTTACCTTGTTACGACTT—3。PCR反應(yīng)體系為50μL體系，包括25μL Premix ExTaq Ver-sion2.0（TAKARA），DNA模板2μL，正反向引物各1μL（10μM），加雙蒸水補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃、30 s，57℃、40 s，72℃、1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保持。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果應(yīng)用BLAST與NCBI—nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到相似度最高的菌屬。通過ClstualX進(jìn)行多序列比對，應(yīng)用MEGA 5.0采用N—J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，置信度檢測自舉數(shù)為1000。

1.2.3菌株生長曲線和濕重的測定 將菌株BHB—16接種于富集培養(yǎng)基中，該菌液與28℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)30 h，每2 h取培養(yǎng)基中菌液2 mL，應(yīng)用751分光光度計(jì)測定其OD600 nm處吸光度，根據(jù)吸光度值和取樣時(shí)間繪制菌株生長曲線。

菌株接種和培養(yǎng)條件與測定生長曲線的條件相同，分別在培養(yǎng)4、8、12、16 h時(shí)，從培養(yǎng)基中取菌液2 mL，應(yīng)用（分光光度計(jì)型號(hào)）測定其OD600 nm處吸光度，另取20 mL菌液，10 000 r/min離心5 min，PBS緩沖溶液清洗兩次，倒掉上清液，測定剩余菌體重量，應(yīng)用菌體重量和吸光度繪制菌株的OD600-濕重曲線，從而利用菌液600 nm處的吸光度來計(jì)算菌液中菌體的濕量。

1.2.4固定化載體預(yù)處理 將載體用清水沖洗數(shù)次，直至將載體上附著的懸浮顆粒物清洗干凈，清洗后的載體自然風(fēng)干。利用排水法測定單位質(zhì)量載體的體積。

1.2.5石油降解菌固定化條件優(yōu)化 將預(yù)處理后的固定化載體加入裝有60 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，于120℃下滅菌30 min，再接種柴油降解菌株BHB—16，分別考察菌體接種量、培養(yǎng)時(shí)間和載體投加量對于菌體固定化的影響。菌體固定化效果用載體固定的柴油降解菌濕重來表示。為了便于表述，后續(xù)將固定化后的和游離的石油降解菌簡稱為固定化菌和游離菌。

1.2.6石油降解率的測定 含有300 mg/L 0#柴油的滅菌海水為培養(yǎng)基，接種最優(yōu)條件下固定化菌，與28℃、80 r/min搖床中振蕩降解7 d。以同樣條件的游離菌作為陽性對照，以不接種任何降解菌作為陰性對照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。柴油降解率的測定采用紫外分光光度法，λ=225 nm。

2結(jié)果與討論

2.1菌株的形態(tài)學(xué)分析

從遼東灣區(qū)域受污染的沉積物中馴化篩選分離得到一株能利用柴油為唯一碳源生長的菌株BHB—16，該菌株菌落呈白色，扁平，表面光滑不透明，邊緣整齊，桿狀，菌株形態(tài)照片如圖1所示。

2.2菌株16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

對降解菌株BHB—16的16s rDNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得長度約為1.5 kb的基因序列，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行Blastn比對分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與Lutibacterium sp.BG—4a（KM404163.1）的序列相似性高達(dá)99%。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行菌株BHB—16的系統(tǒng)發(fā)育分析如圖2所示。

2.3菌株BHB—16生長曲線和濕重的測定

測定菌株生長不同時(shí)間下的濃度值，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，菌株BHB—16在富集培養(yǎng)基中的生長延滯期為8 h左右，培養(yǎng)8 h后，菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，在16 h時(shí)已達(dá)到對數(shù)生長期的后期，20 h達(dá)到生長高峰，此后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。因此，將菌株的培養(yǎng)時(shí)間選為16 h。

菌株BHB—16于不同生長階段的OD600nm吸光度值及菌體濕重的測定結(jié)果如圖4所示，由圖可知，該菌株于600 nm處的吸光度值與菌體的濕重具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，因此，可以通過菌液的吸光度值來計(jì)算其中菌體的濕重。從而能夠采用相同條件下，加入固定化載體培養(yǎng)基和未加入載體培養(yǎng)基中菌液吸光度的變化計(jì)算載體固定菌體的重量。

2.4菌株接種量、培養(yǎng)時(shí)間和載體投加量對菌株固定化效果的影響

分別向含有10 mL兩種不同載體的60 mL富集培養(yǎng)基中，分別接種0.4、0.6、0.8 mL對數(shù)生長后期的石油降解菌BHB—16，在28℃、80 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)32 h，測定菌株固定化效果，結(jié)果見圖5。

由圖5可見，菌株的接種量并不是越多越好，當(dāng)接種量少于0.6 mL時(shí)，載體對于菌株有較好的固定化效果，而接種量高于0.6 mL時(shí)，載體對于菌株的固定化效果出現(xiàn)明顯的下降。原因可能是由于游離態(tài)的菌體過多，從而消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致載體孔隙中菌株生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足，從而導(dǎo)致固定化比例的下降。由此確定菌株固定化中菌株的最適接種量為0.6 mL。

分別向?qū)d體量為10 mL、菌株接種量為0.6 mL的60 mL富集培養(yǎng)基在28℃、80 r/min的搖床中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)時(shí)間為22、24、26、27、28、29、30和31 h時(shí)測定其菌株固定化效果，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可見，該兩種固定化載體對于菌株的固定化效率隨時(shí)間的變化規(guī)律均為先增高后降低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間低于28 h時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，載體對菌株的固定化效率也隨之增加；而當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過30 h后，載體對菌株的固定化效果出現(xiàn)明顯的下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與菌株本身的生長曲線具有一定的相關(guān)性。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過30 h后，菌株的生長進(jìn)人衰亡期，大量的菌體死亡，導(dǎo)致載體表面固定化的菌株大面積脫落，從而降低了載體的固定化效果。由此確定28 h為珊瑚石載體柴油降解菌固定化的最佳培養(yǎng)時(shí)間，29h為沸石載體柴油降解菌固定化的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

分別加入4、6、8、10、12、14、16 mL的不同載體于富集培養(yǎng)基，之后接人菌種O.6 mL，于28℃、80 r/min搖床中培養(yǎng)28 h后，測定菌株固定化的效果，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可見，對于珊瑚石和沸石兩種載體，其載體投加量對于菌株的固定化效率的影響，均是隨載體量增加均呈現(xiàn)先增高后降低的變化規(guī)律。在沸石投加量為10 mL、珊瑚石投加量為12 mL時(shí)，載體中含菌量最多。因此，對于石油降解菌株B HB—16的固定化考察，沸石的最適投加量為10 mL，而珊瑚石的最適投加量為12 mL。

2.5 BHB—16固定化對其石油降解性能的影響

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)獲得的沸石和珊瑚石作為載體對于菌株的最佳固定化條件，對菌株BHB—16進(jìn)行固定化，在含100 mg/L柴油的60 mL無菌海水中分別加入10 mL固定化菌和等量的游離菌，以不加菌的海水作為對照，將菌株于28℃、80 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d，分析它們對0#柴油的降解效果，結(jié)果如表1所示。

從表中可以看出，使用珊瑚石作為載體的實(shí)驗(yàn)組中，游離菌對柴油的降解率為52.5%，而固定化菌對柴油的降解率為82.2%，降解效率提高了29.7%。使用沸石作為載體的實(shí)驗(yàn)組中，游離菌對柴油的降解率為33.9%，而固定化菌對柴油的降解率為48.3%，降解效率提高了14.4%。

兩種不同載體固定化實(shí)驗(yàn)組中游離菌對柴油的降解效率相差18.6%，原因可能是由于相比于沸石，珊瑚石對于菌株的固定率更高。同樣體積的沸石和珊瑚石，珊瑚石固定菌株的重量是沸石的2～3倍。而相比于沸石而言，將珊瑚石作為載體固定菌株后，可有效提高菌體對柴油的降解效率，此外，珊瑚石在沿海區(qū)域中較為常見，環(huán)境友好性更強(qiáng)，因此選用珊瑚石作為載體對石油降解菌BHB—16進(jìn)行固定化，并應(yīng)用于沿海區(qū)域石油污染的修復(fù)，會(huì)產(chǎn)生更好的效果，同時(shí)對環(huán)境產(chǎn)生的影響更小。

3結(jié)論

從遼東灣受污染沉積物中分離篩選出一株石油降解菌，結(jié)合形態(tài)分析以及16S rDNA鑒定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株屬于Lutibac-terium菌屬。

使用沸石作為載體對柴油降解菌BHB—16進(jìn)行固定化效果考察，確定最適的固定化條件為菌體接種量0.6 mL，培養(yǎng)時(shí)間29 h，載體投加量10 mL。

使用珊瑚石作為載體對柴油降解菌BHB—16進(jìn)行固定化，最適的固定化條件為菌體接種量0.6 mL，培養(yǎng)時(shí)間28 h，載體投加量12 mL。

相比于沸石，珊瑚石最為固定化的載體，具有更好的環(huán)境適應(yīng)性，同時(shí)珊瑚石對于柴油降解菌BHB—16的固定化效果更好，對于菌株柴油降解能力的提升更為明顯。