張連水　張慧霞　齊樹亭　張君　王海風(fēng)　張洪志

摘要：以鹽藻為材料，通過便捷性和準(zhǔn)確性的比較對(duì)酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法進(jìn)行系統(tǒng)研究。為結(jié)合酸水解重量法和尼羅紅染色法作出染色藻種油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)尼羅紅染色法定量檢測(cè)，同時(shí)對(duì)尼羅紅染色法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

關(guān)鍵詞：酸水解重量法；蘇丹黑B染色法；尼羅紅染色法；微藻油脂

不同種類微藻的油脂含量差別很大，油脂含量從1%到70%不等，甚至同一種類的不同品系之間也存在很大的差別?，F(xiàn)在已知微藻有10 000余種，從中篩選出油脂含量高的微藻是一項(xiàng)繁重的工作，采用一種簡(jiǎn)便、快速、有效的微藻油脂提取方法無(wú)疑會(huì)事半功倍。目前，研究者常采用油脂提取方法有：酸熱法、索氏提取法、超臨界CO₂萃取法（SCF.CO₂法）和有機(jī)溶劑法，有報(bào)道利用這四種方法對(duì)真菌油脂進(jìn)行提取，并對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行了比較，并得出對(duì)于微藻而言，尼羅紅是最為簡(jiǎn)單、快捷測(cè)定油脂的方法。

本實(shí)驗(yàn)通過便捷性和準(zhǔn)確性的比較，對(duì)酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法進(jìn)行系統(tǒng)研究。為結(jié)合酸水解重量法和尼羅紅染色法作出染色藻種油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)尼羅紅染色法定量檢測(cè)，同時(shí)對(duì)尼羅紅染色法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)。

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

用于本實(shí)驗(yàn)的鹽藻由海洋中心藻種實(shí)驗(yàn)室提供。藻種使用前進(jìn)行超聲波破壁處理。由于在之后蘇丹黑B測(cè)定油脂含量、尼羅紅測(cè)定油脂含量中均需要繪制油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以此處藻種均進(jìn)行冷凍處理，使其生長(zhǎng)狀態(tài)及油脂含量基本保持在恒定狀態(tài)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

將實(shí)驗(yàn)用藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每天測(cè)定藻樣620 nm處的吸光度，并且進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板法平行計(jì)數(shù)，繪制藻樣吸光度值與細(xì)胞密度的關(guān)系圖。分別用酸水解重量法、蘇丹黑B染色法、尼羅紅染色法對(duì)藻類進(jìn)行油脂含量測(cè)定。

探究染色時(shí)間對(duì)染色后藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響。取1.0 mg/mL的鹽藻藻液（之前經(jīng)過超聲波破壁處理），加人尼羅紅，使其最終質(zhì)量濃度為1μg/mL，37℃水浴避光染色一段時(shí)間（1、3、6、9、12、15、18、20 min），480 nm激發(fā)光下，測(cè)量580nm處熒光強(qiáng)度。同時(shí)探究尼羅紅質(zhì)量濃度對(duì)藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響，取8份1.0 mg/mL的鹽藻藻液（之前經(jīng)過超聲波破壁處理），加入尼羅紅，使其最終質(zhì)量濃度為分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL，37℃水浴避光染色9min，480 nm激發(fā)光下，測(cè)量580 nm處熒光強(qiáng)度。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1藻體吸光度值與細(xì)胞密度的關(guān)系

由圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出：鹽藻的個(gè)體數(shù)與吸光度值基本呈正比，不同濃度的鹽藻液與細(xì)胞密度之間的關(guān)系系數(shù)均較好。經(jīng)回歸分析，鹽藻的細(xì)胞密度與光密度之間成直線關(guān)系，由于鹽藻形狀規(guī)則，光密度與細(xì)胞密度之間的相關(guān)性很好。將鹽藻密度與吸光度值進(jìn)行回歸，回歸方程為：y=0.013 9x-0.0055，R²=0.9792。

2.2酸水解法

對(duì)鹽藻進(jìn)行酸水解法提取油脂測(cè)得不同梯度油脂含量，由此數(shù)據(jù)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程和判別系數(shù)如圖2。分析得到的判別系數(shù)：

R²=0.998 4，表明由兩變量相關(guān)性得到的回歸方程適配數(shù)據(jù)，具有高度的擬合優(yōu)度。且ml=0.304，m2=0.301 5，相對(duì)誤差為0.82%。

2.3藻體濃度與蘇丹黑B染色后A645的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3分析得到的判別系數(shù)R²=0.9925，表明由兩變量相關(guān)性得到的回歸方程適配數(shù)據(jù)，具有高度的擬合優(yōu)度。

2.4蘇丹黑B染色后A645與油脂含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4可分析得到判別系數(shù)R³=0.949 4，表明由兩變量相關(guān)性得到的回歸方程適配數(shù)據(jù)，擬合優(yōu)度一般。且由可行性驗(yàn)證可知ml=3.097、m2=3.015。相對(duì)誤差為2.65%。

由此可以判定經(jīng)蘇丹黑B染色處理的微藻細(xì)胞對(duì)645 nm波長(zhǎng)光具有最大吸收峰值。微藻油脂含量與經(jīng)蘇丹黑B染色處理后微藻細(xì)胞的吸光值A(chǔ)645呈一定程度的線性相關(guān)性，但存在一定誤差。

2.5染色時(shí)間對(duì)藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響曲線

由圖5可知染色時(shí)間在8 min之前隨著時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)熒光強(qiáng)度不斷增大，之后在8～15min之內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度基本無(wú)明顯變化，15 min之后相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯下降且下降幅度較大。由此可知最佳染色時(shí)間在8～9 min。

2.6尼羅紅質(zhì)量濃度對(duì)藻液細(xì)胞發(fā)射光譜的影響曲線

由圖6可知尼羅紅終濃度在0.7μg/mL之前隨著濃度的增加相對(duì)熒光強(qiáng)度不斷增大，之后尼羅紅濃度在O.7～1.2μg/mL之間相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。尼羅紅濃度在1.2μg/mL之上時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度緩慢下降，由此可知尼羅紅的最佳終濃度為0.7～1.0μg/mL。

2.7三種方法的對(duì)比分析

綜合實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)論對(duì)比分析三種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，如表1。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)論

酸水解稱重法實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)較長(zhǎng)，且需用到多種有機(jī)試劑具有毒性。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為準(zhǔn)確，且無(wú)論使用任何方法如需定量測(cè)定微藻內(nèi)油脂含量的大小，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)均要用到此方法進(jìn)行協(xié)助。蘇丹黑B染色法較為簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)藥品實(shí)驗(yàn)器材要求較低，但測(cè)量結(jié)果并不十分準(zhǔn)確，可以作為定性判斷微藻油脂含量的方法。尼羅紅染色法對(duì)藥品儀器要求較高，但實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)便，且實(shí)驗(yàn)精度高?？梢宰鳛榭焖俣ㄐ耘袛辔⒃逵椭康姆椒ǎ部山Y(jié)合稱重法作為同種藻種快速定量判斷的方法。染色時(shí)間對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響：尼羅紅染色法的最佳染色時(shí)間在8～9 min。尼羅紅終濃度對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響：尼羅紅染色法的尼羅紅的最佳終濃度為0.7～1.0μg/mL。