錢瑞+張壯志+孫娟+趙楠+潘金華+羅世菊+王偉偉

摘要：通過設(shè)置不同的培養(yǎng)條件，檢驗(yàn)溫度、光照強(qiáng)度和光照周期對(duì)裙帶菜雌配子體生長(zhǎng)的影響。第一步設(shè)置3個(gè)溫度條件（12℃、16℃、20℃）和5個(gè)光照強(qiáng)度條件（1000、1500、2000、2500、3000 lx）進(jìn)行全析因方差設(shè)計(jì)，得出最適溫度條件和光照強(qiáng)度；第二步，在最適溫度條件下，設(shè)置2個(gè)光照周期（24 h持續(xù)光照和光暗周期D：L=12：12）和不同光照強(qiáng)度，檢驗(yàn)不同光照強(qiáng)度條件和光照周期對(duì)配子體生長(zhǎng)的影響。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)最適溫度條件和光照周期，設(shè)置不同光照強(qiáng)度檢驗(yàn)其對(duì)配子體鮮重量生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：裙帶菜雌配子體最適宜的在溫度為16℃，光照強(qiáng)度為2500 lx，周期為24 h持續(xù)光照。

關(guān)鍵詞：溫度；光照；光照周期，裙帶菜雌配子體；生長(zhǎng)

裙帶菜（Undaria pinnatifida）是一種一年生褐藻，隸屬于海帶目，生活在潮下帶。裙帶菜是我國(guó)黃渤海海域的山東半島、遼東半島重要栽培海藻之一，在黃渤海海域范圍內(nèi)，其產(chǎn)業(yè)規(guī)模僅次于海帶，與海帶、紫菜并稱中國(guó)三大經(jīng)濟(jì)海藻。我國(guó)產(chǎn)裙帶菜早年主要向日本出口，近年來國(guó)內(nèi)消費(fèi)迅速增長(zhǎng)，成為人們喜愛的“海洋堿性蔬菜”。裙帶菜生活史分為孢子體世代和配子體世代，國(guó)內(nèi)對(duì)裙帶菜的基礎(chǔ)生物學(xué)研究已經(jīng)比較清楚，大大加快了國(guó)內(nèi)裙帶菜苗種生產(chǎn)的步伐。裙帶菜生活史中具有明顯的世代交替，分為孢子體世代和配子體世代，裙帶菜苗種培育既可以利用孢子體采苗，也可以利用保存的配子體進(jìn)行育苗，采用配子體克隆進(jìn)行幼苗培育，可以避免只能由孢子體采苗獲得配子體的季節(jié)性限制，可以隨時(shí)為裙帶菜遺傳育種和其他基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。因此裙帶菜配子體的快速擴(kuò)增培養(yǎng)成為其有效利用的重要前提，本研究對(duì)影響裙帶菜♀配子體的溫度、光照強(qiáng)度和光照周期條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，以期為裙帶菜配子體克隆快速擴(kuò)增培養(yǎng)提供基礎(chǔ)指導(dǎo)。

1材料和方法

1.1材料來源

裙帶菜配子體克隆細(xì)胞（♀）來自國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件為20±2℃，光強(qiáng)1 500～2 000 lx，24 h持續(xù)光照。培養(yǎng)液為自然海水加煮沸消毒，然后添加N和P營(yíng)養(yǎng)鹽（NaNOs 60 mg/L，KH2 P04 10mg/L），煮沸消毒后備用。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1.2.1溫度和光照強(qiáng)度對(duì)裙帶菜配子體生長(zhǎng)影響 設(shè)置光照培養(yǎng)箱溫度12℃、16℃和20℃，光照強(qiáng)度1000，1500，2000，2500和3000 lx，光照周期24 h持續(xù)光照，共15個(gè)組合，每組3個(gè)重復(fù)，共45個(gè)樣本。將裙帶菜配子體（雌配子體，下文提到配子體均指裙帶菜雌配子體），轉(zhuǎn)入100mL三角燒瓶，用超聲波破碎儀（型號(hào)：JY92-IIN）打碎，經(jīng)300目篩絹過濾至500 mL燒杯中。加入培養(yǎng)液至300 mL稀釋，用移液管均勻吸入8mL分別放人45套120 mm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿裝入90 mL培養(yǎng)液，分別進(jìn)入光照培養(yǎng)箱內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組合。每5 d更換培養(yǎng)液一次，每次更換總體積的60%左右。持續(xù)觀測(cè)4周時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用倒置顯微鏡對(duì)各實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行拍照（O-lympus IX51），然后利用軟件Image pro測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組裙帶菜配子體細(xì)胞系長(zhǎng)度。

1.2.2光照周期對(duì)配子體生長(zhǎng)的影響 在溫度和光照強(qiáng)度對(duì)裙帶菜配子體實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，篩選出適合的溫度條件和光照強(qiáng)度條件之后，根據(jù)最適溫度件，設(shè)置不同光照周期和光照強(qiáng)度，檢驗(yàn)不同光照周期和光照強(qiáng)度條件下裙帶菜配子體生長(zhǎng)和發(fā)育狀態(tài)。經(jīng)過上面實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)16℃條件最適合裙帶菜配子體生長(zhǎng)。設(shè)置光照培養(yǎng)箱溫度16℃，光照強(qiáng)度為1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 lx，光照周期為D：L=12：12 h和24 h持續(xù)光照，溫度為16℃，共10個(gè)組合，每個(gè)組合設(shè)置3個(gè)平行，共30個(gè)樣本。樣本準(zhǔn)備方法同1.2.1。培養(yǎng)2周之后，觀測(cè)各實(shí)驗(yàn)條件下裙帶菜配子體生長(zhǎng)長(zhǎng)度。

1.2.3不同光照條件下配子體生長(zhǎng)鮮重影響溫度條件定為16℃，光照周期為24D h，光照強(qiáng)度500、1500、2 500、3 500和4 500 lx，共5個(gè)實(shí)驗(yàn)組合，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組合設(shè)置3個(gè)平行，共15個(gè)樣本。配子體的準(zhǔn)備方法同1.2.1，用移液管均勻吸入10 mL分別放人15個(gè)三角燒瓶中。每5 d左右更換1次培養(yǎng)液，每次更換量為三角燒瓶中的培養(yǎng)液量的60%。三角燒瓶中克隆質(zhì)量相同（鮮重50 mg），培養(yǎng)12周后測(cè)量（分析天平XSE205DU）培養(yǎng)皿中克隆質(zhì)量。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用雙因素方差分析檢驗(yàn)溫度和光照強(qiáng)度對(duì)裙帶菜配子體生長(zhǎng)的影響，以及光照周期和光照強(qiáng)度對(duì)配子體生長(zhǎng)的影響。采用單因素方差分析檢驗(yàn)光照強(qiáng)度對(duì)配子體鮮重生長(zhǎng)的影響。顯著水平設(shè)為P<0.05。統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS13.0進(jìn)行。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1溫度和光照強(qiáng)度對(duì)裙帶菜配子體生長(zhǎng)影響

初期超聲波打碎克隆受損，在所實(shí)驗(yàn)的3個(gè)溫度條件下，光照強(qiáng)度低的實(shí)驗(yàn)組合生長(zhǎng)較快，其中20℃更為明顯；培養(yǎng)10 d后，16℃和2 500 lx條件下配子體細(xì)胞生長(zhǎng)最快，溫度為20℃和12℃的條件下1 500 lx的光照強(qiáng)度生長(zhǎng)較好；培養(yǎng)21 d后，16℃和2 500 lx條件下配子體生長(zhǎng)最快。12℃和2 500 lx條件下的配子體細(xì)胞生長(zhǎng)較好，溫度為20℃時(shí)，光照強(qiáng)度1500 lx的條件下的克隆細(xì)胞生長(zhǎng)較好。經(jīng)過3周的培養(yǎng)，最終測(cè)得在16℃和光照強(qiáng)度2 500 lx條件下，裙帶菜配子體細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)度最大平均長(zhǎng)度達(dá)2364μm（圖1）。在實(shí)驗(yàn)條件下，裙帶菜雌配子體最適生長(zhǎng)溫度和光照強(qiáng)度條件分別為16℃和2 500 lx。（不同小寫字母表不差異顯著，ANOVA，P<0.05.平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2光照周期對(duì)配子體生長(zhǎng)的影響

16℃條件下，光照周期為12 L：12 D時(shí)培養(yǎng)前期生長(zhǎng)較好，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，從低光到光逐步發(fā)現(xiàn)裙♀配子體樣本發(fā)育長(zhǎng)出幼孢子體（圖2），因此在光暗交替的光照周期為12L：12D的條件下，會(huì)誘發(fā)裙♀孤雌生長(zhǎng)，不適宜裙帶菜雌性配子體的培養(yǎng)。而在光照周期為24持續(xù)光照條件下，光照強(qiáng)度為2 000 lx時(shí)，配子體細(xì)胞系生長(zhǎng)最快，配子體細(xì)胞最大平均長(zhǎng)度達(dá)到680.8tim，但是2000 lx和2 500 1x實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著（圖3）。

2.3不同光照條件下配子體生長(zhǎng)鮮重影響

在溫度為16℃，光照周期24 h持續(xù)光照，經(jīng)過7周的培養(yǎng)，在2 500 lx光照強(qiáng)度條件下，裙帶菜雌配子體鮮重量生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到0.31 g（圖4）。實(shí)驗(yàn)表明克隆細(xì)胞打碎平均分配12周后在光照強(qiáng)度為2 500 lx的條件下生長(zhǎng)最快，質(zhì)量最重。

3結(jié)論

本研究通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同溫度、光照強(qiáng)度和光照周期條件，檢驗(yàn)其對(duì)裙帶菜雌配子生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在溫度為16℃，光照周期為24 h持續(xù)光照時(shí)，光照強(qiáng)度為2 500 lx時(shí)，最適宜裙帶菜雌配子生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該注意將裙帶菜配子體擴(kuò)培粉碎后，應(yīng)該先放人1000 lx的條件下培養(yǎng)5 d左右進(jìn)行恢復(fù)，恢復(fù)后再分流進(jìn)入各個(gè)實(shí)驗(yàn)組合。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，裙帶菜雌配子體在具有光暗周期的條件下，會(huì)產(chǎn)生配子體直接轉(zhuǎn)化為孢子體的“孤雌生殖”現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用的光照黑暗周期為L(zhǎng)：D=12 h：12 h，其它光暗交替周期對(duì)裙帶菜雌配子體孤雌生殖的影響有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)，裙帶菜雌配子體孤雌生殖產(chǎn)生的幼孢子體后代長(zhǎng)大后的形狀表現(xiàn)也值得進(jìn)一步深入研究，這或許為裙帶菜新品種開發(fā)和培育提供了一種新的思路和方法。