王耀磊，周志強，吳成穩(wěn)，李祥波，李飛

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院 血管外科，河南 鄭州 450014）

論著

縫隙連接蛋白43與基質金屬蛋白酶9在人股動脈粥樣硬化斑塊中表達分析

王耀磊，周志強，吳成穩(wěn)，李祥波，李飛

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院 血管外科，河南 鄭州 450014）

目的探討縫隙連接蛋白43（CX-43）與基質金屬蛋白酶9（MMP-9）在人股動脈粥樣硬化（AS）斑塊中的表達及其與斑塊穩(wěn)定性關系。方法收集股動脈內膜剝脫術后所得AS斑塊標本47例，正常脾動脈、腸系膜上動脈組織標本21例作為對照組。根據術前彩超及術后病理檢查結果進行分組：穩(wěn)定斑塊組（22例）和不穩(wěn)定斑塊組（25例），免疫組織化學SP法檢測各標本中CX-43和MMP-9的表達以及兩者之間的相關性。結果CX-43和MMP-9蛋白在對照組、穩(wěn)定斑塊組及不穩(wěn)定斑塊組中的表達均有差異（FCX-43=662.971，FMMP-9=397.716），差異有統計學意義（P<0.05）。和對照組比較，斑塊組CX-43和MMP-9表達均增高，差異有統計學意義（P<0.05）。不穩(wěn)定斑塊組較穩(wěn)定斑塊組CX-43和MMP-9表達明顯增強，且差異有統計學意義（P<0.05）。相關性研究結果顯示，CX-43和MMP-9在AS組表達呈正相關（r穩(wěn)定斑塊組=0.640，P<0.05；r不穩(wěn)定斑塊=0.715，P<0.05），對照組研究結果提示CX-43與MMP-9無明顯相關性。結論 CX-43和MMP-9蛋白表達的上調促進人股動脈粥樣硬化斑塊形成以及斑塊組織的不穩(wěn)定性。

動脈粥樣硬化；縫隙連接蛋白43；基質蛋白酶9

近年來隨著生活水平的提高、運動量減少及人口老齡化的加快，動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）發(fā)病率逐年升高，已嚴重威脅人類健康。下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是AS局部表現，一般表現為間歇性跛行、靜息痛、壞疽甚至面臨截肢風險，因此探究AS病因及發(fā)病機制、尋找預防和治療手段、提高生存率、降低截肢率并改善患者生活質量意義重大?？p隙連接蛋白43（connexin 43，CX-43）是一種六聚體親水性蛋白，巨噬、平滑肌、血管內皮以及成纖維細胞通過其達成信息和物質交流，其關鍵作用點在于促進血管內皮的損傷、泡沫細胞形成、平滑肌細胞增殖和內遷以及不穩(wěn)定斑塊形成?；|蛋白酶9（matrix metall proteinase，MMP-9）又名明膠酶B，主要作用于由膠原、蛋白聚糖及糖蛋白組成網狀結構的細胞外基質，從而引起動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽破裂、血栓形成等一系列繼發(fā)性病變。本實驗旨在通過研究CX-43和MMP-9在動脈粥樣硬化斑塊中表達情況，探討兩者表達變化在AS發(fā)生發(fā)展中作用機制以及可能的治療靶點。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集鄭州大學第二附屬醫(yī)院2013年9月-2015年11月通過股動脈內膜剝脫術獲得的股AS斑塊標本47例。其中，男性29例，女性18例。另外收集因腹部外傷、門靜脈高壓行脾臟切除術以及胃腸道手術獲得完整脾動脈、腸系膜上動脈標本共21例（對照組）。其中，男性15例，女性6例。每位患者術前均已簽署《股AS斑塊手術標本研究知情同意書》，術中標本離體后迅速置于液氮保存，石蠟包埋切片備檢。

1.2標本分組及染色

根據彩超及病理檢測結果將收集的標本分組，對照組（21例）、穩(wěn)定斑塊組（22例）及不穩(wěn)定斑塊組（25例），然后常規(guī)進行固定、脫水包埋、切片（厚4μm/張）、脫蠟、水化、最后蘇木素-伊紅（HE）染色。

1.3方法與儀器設備

采用鏈霉菌抗生物素酶蛋白-過氧化物酶（SP）免疫組織化學法，具體步驟參照SP試劑盒說明書。光學顯微鏡下觀察股動脈斑塊組織和正常動脈，可見：以可見棕黃色或棕褐色顆粒作為CX-43和MMP-9蛋白陽性表達標準。每張圖片取5個視野進行圖像采集，應用IPP 6.0測量計算所采集切片積分吸光度值，該樣本被測蛋白的表達以5個視野的平均值表示。兔抗人CX-43單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體購自美國Santa cruz公司，切片圖像采集應用lecia顯微照相系統（德國lecia公司），應用Biosens Digital Imaging System v1.6（上海山富科學儀器有限公司）對所采集切片的陽性細胞積分吸光度值（integral optical density，IOD）進行計算，求出其平均值作為該樣本蛋白陽性表達量。SP900試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）試劑盒均購自北京中杉生物工程有限公司。

1.4統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，結果以均數±標準差（）表示，3組間做比較采用單因素方差分析，Bonferroni法兩兩比較，股AS斑塊中CX-43和MMP-9蛋白表達做相關性分析時采用Pearson法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1人股動脈粥樣硬化斑塊病理檢測結果

對照組脾動脈和腸系膜上動脈內皮細胞整齊，內膜光滑且內、中、及外3層膜結構均完整存在。穩(wěn)定斑塊組脂質核心區(qū)小于斑塊面積40%，光鏡下內皮細胞紊亂無序，纖維帽較厚，相對較少的泡沫及炎癥細胞及鈣化灶存在；不穩(wěn)定斑塊組脂質核心區(qū)較大，超過斑塊面積40%，內皮細胞排列呈偏心性，較薄的纖維帽，相對較多的炎癥、泡沫細胞，斑塊基底部可見大量新生血管和膽固醇結晶。

2.2股AS斑塊組織、正常動脈組織中CX-43與MMP-9表達比較

MMP-9和CX-43蛋白主要表達在單核-巨噬細胞、泡沫細胞以及血管平滑肌細胞中。其中CX-43蛋白在炎癥細胞浸潤區(qū)及血管分叉處內皮細胞中表達尤其明顯。（見附表、附圖）。

CX-43和MMP-9蛋白表達：與對照組比較，斑塊組表達升高，且兩者在穩(wěn)定斑塊組表達明顯弱于不穩(wěn)定斑塊組（FCX-43=662.971，P<0.05，FMMP-9=397. 716，P<0.05），（見附表、附圖）。

2.3相關性分析

CX-43與MMP-9蛋白在穩(wěn)定斑塊組表達呈正相關（r=0.640，P<0.05），不穩(wěn)定斑塊組中也具有正相關關系（r=0.715，P<0.05）。

附表　各組標本中CX-43與MMP-9蛋白的表達比較 （）

附表　各組標本中CX-43與MMP-9蛋白的表達比較 （）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與穩(wěn)定斑塊組比較，P<0.05

組別MMP-9蛋白對照組　1.964±0.009穩(wěn)定斑塊組　2.077±0.0311）CX-43蛋白21　1.954±0.082 22　2.061±0.0341）不穩(wěn)定斑塊組　25　2.248±0.0321）2）　2.169±0.0271）2）例數

附圖　各組標本中CX-43和MMP-9蛋白的表達 （SP，×400）

3　討論

AS是動脈壁慢性炎癥反應過程[1]，其本質是脂質沉積、泡沫細胞生成、內膜局灶狀纖維化和粥樣硬化斑塊形成，最終導致一系列繼發(fā)性病變。CX-43是一種六聚體親水性蛋白，巨噬、平滑肌、血管內皮以及成纖維細胞中通過其達成信息和物質交流，其中CX-43蛋白與AS關系最密切，血流剪切力較大部位如血管分叉處表達尤其明顯[2]，內皮細胞受損導致細胞因子、生長因子以及血管活性物質分泌失調，進而引起平滑肌增殖和遷徙[3]。平滑肌細胞以表型轉化方式通過內彈力膜向內膜增生和遷徙，后經受體介導的方式吞噬脂質，肌源性泡沫細胞形成，以上過程均體現在國外學者研究中。平滑肌細胞增生遷徙形成粥樣斑塊纖維帽，同時細胞中CX-43表達上調，該結果提示CX-43過表達在平滑肌增生和遷徙過程中發(fā)揮關鍵作用。單核細胞與內皮細胞發(fā)生黏附，由中膜內遷至內膜后，轉化為巨噬細胞并經受體介導吞噬大量氧化變性的低密度脂蛋白，大量膽固醇被攝入，單核源性泡沫細胞形成[4-6]，該過程往往發(fā)生在血管內皮損傷或炎癥反應后。國外學者對AS發(fā)病機制研究后發(fā)現，對內皮細胞采用選擇性敲除CX-43基因等手段，可減少黏附分子表達，進而減少單核-內皮細胞的黏附與遷徙[7]。大量氧化低密度脂蛋白在巨噬細胞釋放活性氧后生成，進而使平滑肌源、單核細胞源泡沫細胞均崩解壞死，形成糜粥樣壞死物。近年來研究發(fā)現，CX-43通過Ras基因家族的RhoA影響巨噬細胞的胞吞作用，因而間接證實巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白的增多由CX-43表達增多所致[8]。另外由巨噬細胞分泌的基質金屬蛋白酶激活后具有生物活性，分解基質削薄粥樣硬化纖維蛋白帽，是不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽的破裂及血栓形成的主要原因。

MMP-9又名明膠酶B，是具有Zn2+離子依賴性的肽鏈內切酶，主要作用于由膠原、蛋白聚糖及糖蛋白組成的網狀結構細胞外基質。MMP-9首先以無活性酶原的形式分泌到細胞外，CatS將其前驅肽鏈水解，封閉Zn2+活性中心的半胱氨酸脫離，MMP-9激活完成，MMP-9活化后可降解細胞外基質重要組成成分，基膜IV型膠原，引起斑塊ECM降解大于合成[9]，進而導致血管壁屏障破壞，其與單核、平滑肌細胞增生和內遷、低密度脂蛋白的沉積關系密切，另外分解基質削薄粥樣硬化纖維蛋白帽，是不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽的破裂及血栓形成的主要原因[10]。國外學者對動脈粥樣硬化致頸動脈狹窄患者抽血研究表明，MMP-9在不穩(wěn)定斑塊組患者血漿中表達明顯，進一步證實MMP-9致斑塊不穩(wěn)定作用[11]。本實驗結果顯示：與對照組比較，CX-43和MMP-9表達量在斑塊組較高，且兩者在穩(wěn)定斑塊組表達明顯弱于不穩(wěn)定斑塊組，同時相關性分析結果顯示，在AS形成過程中兩者正相關，且就相關系數（r）而言穩(wěn)定斑塊組明顯低于不穩(wěn)定斑塊組，以上結果均提示CX-43和MMP-9蛋白與AS疾病發(fā)生發(fā)展關系密切。有國外學者研究表明激活的單核細胞通過增強CX-43構建的縫隙連接通道而釋放基質金屬蛋白酶[12]，該結論正好與本實驗中CX-43與MMP-9正相關相符。縫隙連接的建立來源于CX-43的高表達，單核細胞激活后通過該通道，以電信號、化學信號的的形式將信息傳遞至周圍細胞，從而引起單核細胞的瀑布效應，導致更多的MMP-9形成，最終以不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽的破裂、以及血栓的形成結局。

綜上所述，股AS的形成是多方面原因共同作用結果，抑制或者拮抗CX-43與MMP-9的表達可減緩AS發(fā)展、增加斑塊穩(wěn)定性，以上這些都為臨床治療動脈粥樣硬化提供了新思路及治療靶點。

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（張蕾編輯）

Expression of CX-43 and MMP-9 in atherosclerotic p laques of human femoral artery

Yao-leiWang，Zhi-qiang Zhou，Cheng-wen Wu，Xiang-bo Li，Fei Li
（Department of Vascular Surgery，the Second Affiliated Hospital Of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450014，China）

Objective To discuss the expression levels of CX-gap junction protein 43（CX-43）and matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in atherosclerotic plaques of human femoral artery，and their correlations with the stability of the plaques.M ethods Totally 68 specimens were collected，of which 47 atherosclerotic plaque specimens were from patients who underwent femoral artery endarterectomy（experimental group）and 21 specimens were from normal splenic artery or superiormesenteric artery（control group）.Then the47 atherosclerotic plaque specimens were divided into stable-plaque group（22 cases）and unstable-plaque group（25 cases）according to ultrasonography and pathological results.Using immunohistochemical SP method the expression levels of the CX-43 and the MMP-9 were detected，and their relationship was investigated.Results There were significant differences in the expression levels of CX-43 and MMP-9 among the control group，the stable plaque group and the unstable plaque group（FCX-43=662.971，P＜0.05；FMMP-9=397.716，P＜0.05）.Compared with the control group，the expression levels of CX-43 and MMP-9 in the atherosclerosis group were significantly increased（P＜0.05）.The expression levels of CX-43 and MMP-9 in the unstable plaque group were significantly higher than those in the stable plaque group（P＜0.05）.The result of the correlation research showed that the expression levels of CX-43 and MMP-9 in the atherosclerosis groups were positively correlated（rstable=0.640，P＜0.05；runstable=0.715，P＜0.05），but they had nosignificant correlation in the control group.Conclusions Up-regulation of CX-43 and MMP-9 protein expressions could promote the formation of atherosclerosis plaques in human femoral artery and cause instability of the plaque tissue.

atherosclerosis；CX-gap junction protein 43；martix metalloproteinase 9

R 654.3；R 543.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.010

1005-8982（2016）14-0048-04

2016-01-26

周志強，E-mail：qiang6364@sohu.com；Tel：13937104760