于　鴻　張耿月　魏天雪　何春瑩　劉玉俠吉林省腫瘤防治研究所，吉林長春　130012

不同來源的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞體外抗腫瘤作用的比較研究

于鴻張耿月魏天雪何春瑩劉玉俠▲
吉林省腫瘤防治研究所，吉林長春130012

［摘要］目的比較來自臍帶血和惡性腫瘤患者外周血的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK）體外抗腫瘤作用的差異。方法 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)肺癌患者外周血和臍血來源的CIK細胞，MTT法和流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)的CIK細胞的抗腫瘤活性及機制。結(jié)果 來自肺癌患者外周血和臍血的CIK細胞中CD3+細胞、CD3+CD56+和CD3+CD8+細胞百分比均伴隨培養(yǎng)時間的延長而升高，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異；誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d時，臍血CIK細胞和肺癌患者外周血來源的CIK細胞的增殖率分別為（185.76±39.68）%、（254.32±74.60）%，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0012）；臍血CIK細胞的抗腫瘤活性高于肺癌患者外周血來源的CIK細胞（效靶比10∶1，靶細胞為K562細胞時，P=0.0016；靶細胞為A549細胞時，P=0.0022）；臍血CIK細胞CD107a表達高于來自肺癌患者外周血的CIK細胞（靶細胞為K562細胞時，P=0.0469；靶細胞為A549細胞時，P=0.0413）；臍血CIK細胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平高于肺癌患者CIK細胞（P=0.0352；P=0.0389）；臍血CIK細胞和肺癌患者CIK細胞誘導(dǎo)K562細胞凋亡的百分率為（25.30±4.87）%和（19.87±5.41）%，二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.2658）。結(jié)論 流式細胞術(shù)可同時檢測CIK細胞的表型、功能及作用機制。本研究為臨床應(yīng)用CIK治療提供更多選擇和實驗室依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞；流式細胞術(shù)；免疫治療；CD107a

細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一群異質(zhì)性的具有抗腫瘤作用的細胞。CIK細胞主要表達CD3和CD56，抗腫瘤活性強，增殖迅速。用患者自身PBMC誘導(dǎo)的CIK細胞已經(jīng)顯示良好的臨床療效，尤其對慢性髓系白血病、肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等［1］。但是腫瘤患者在經(jīng)歷了放化療后，經(jīng)常出現(xiàn)白細胞減少、貧血等癥狀。尤其晚期惡性腫瘤患者每毫升外周血中單核細胞的數(shù)量也較正常人少。因此為了減輕患者負擔(dān)，提高臨床療效，本研究比較了來自健康捐助者的臍血CIK細胞和來自肺癌患者外周血的CIK細胞在體外的抗腫瘤作用，并初步探討了其機制上的差異，以尋找更有效可行的CIK治療方法。

1　材料與方法

1.1材料來源

白血病細胞系K562和肺癌細胞系A(chǔ)549由吉林省腫瘤防治研究所常規(guī)傳代培養(yǎng)。Recombinant hu man interleukin（IL）-2、IFN-γ、CD3-mAb（OKT-3）、IL-1α購自Biolegend。PI、anti-CD3-ECD、anti-CD56-PC5、anti-CD8-PC5、anti CD3-FITC、anti-CD8-FITC及相應(yīng)的同型對照抗體均購自貝克曼庫爾特公司。5，6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyester（CFSE）購自Molecular Probes。Annexin V apoptosis kit購自BD公司。MonensinSolution（BioLegend，Cat.420701）。PE anti-human CD107a（Lysosome-Associated Membrane Protein1，LAMP-1，BioLegend，Cat.328608，Clone：H4A3）。CCK-8購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細胞肺癌患者外周血 （4份，10 mL/份）來自吉林省腫瘤醫(yī)院住院患者（2014年8月～2015年8月）；4份臍血（10 mL/份）來自吉林省婦幼保健院（2014年8月～2015年8月）。血液樣本分別經(jīng)紅細胞裂解液處理后，獲得的細胞被培養(yǎng)在IMDM培養(yǎng)基中（10%FCS，37℃，5%CO2飽和濕度），細胞濃度（1～2）×106/mL。培養(yǎng)24 h后，加入1000 U/mL IFN-γ，CD3-mAb（50 ng/mL），IL-2（300 U/mL），IL-1α（100 U/mL），繼續(xù)培養(yǎng)并每3天半量換液或擴瓶1次，同時補加IL-2（300 U/mL）。在培養(yǎng)的第14天和第21天收獲細胞，流式細胞儀檢測分析（Beckman Coulter Epics XL-MCL）細胞表型，即 CD3+CD56+、CD3+CD8+細胞百分率。

1.2.2CIK細胞增殖實驗采用CCK-8染色法檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的臍血CIK細胞和來自肺癌患者外周血的CIK細胞的增殖率。調(diào)整CIK細胞的初始密度為5×104/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天擴瓶1次，CCK-8染色，酶標(biāo)儀檢測（490 nm），直到第21天，計算增殖率并分析比較實驗結(jié)果。

1.2.3CIK細胞體外抗腫瘤活性實驗（流式細胞儀法）標(biāo)記靶細胞：A549和K562細胞用PBS洗1遍，調(diào)整細胞濃度為1.5×106/mL，CFSE（2.5 μmol/L）標(biāo)記細胞，37℃孵育8 min，PBS洗細胞1次，加入1 mL IMDM（含10%FCS），室溫避光孵育10 min，再加入PBS洗細胞1次備用。標(biāo)記效應(yīng)細胞：調(diào)整CIK細胞濃度為1×106/100 μL，標(biāo)記用CD3、CD8和CD56抗體，室溫避光孵育30 min，細胞用PBS洗1次備用。調(diào)整靶細胞密度為5×104/mL，設(shè)置不同的效靶比，分別為1∶1、5∶1、10∶1，相應(yīng)的CIK效應(yīng)細胞濃度分別為5×104/mL、25×104/mL、50×104/mL，分別設(shè)單獨的靶細胞和效應(yīng)細胞對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PI染色，流式細胞儀檢測分析。

1.2.4CIK細胞體外抗腫瘤活性實驗 （MTT法）按上述同樣的效靶比將細胞接種于96孔板中，靶細胞濃度為2×104/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入CIK細胞，MTT法檢測CIK對靶細胞的殺傷效率。酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度（A）值。抑制率（%）= ［1-（實驗組A值-CIK細胞A值）/腫瘤細胞A值］× 100%。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1檢測CIK細胞CD107a表達 調(diào)整CIK細胞濃度為1×106/100 μL，加入CD107a-PE（10 μL），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，加入Monensin，將效應(yīng)細胞和靶細胞按10∶1的效靶比混合，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，PBS洗細胞1次，標(biāo)記細胞用相應(yīng)的CD3、CD8和CD56抗體，2%多聚甲醛固定細胞，流式細胞儀檢測分析。實驗設(shè)陰性對照（單獨CIK組）以控制自發(fā)產(chǎn)生的CD107a。

1.3.2細胞因子的檢測按前述方法將10∶1混合的效靶細胞（A549）培養(yǎng)24 h后，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α表達。

1.3.3細胞凋亡實驗按前述方法將10∶1混合的效靶細胞（K562）培養(yǎng)24 h后，收集細胞，Annexin V/PI染色，流式細胞儀檢測分析，每個樣本收集10000個細胞。數(shù)據(jù)分析采用Coulter EXPO 32 v1.2軟件。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細胞表型

來自肺癌患者外周血和臍血的CIK細胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天和第21天的細胞表型檢測結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)的延長，CD3+細胞、CD3+CD56+和CD3+CD8+細胞百分比升高（圖1）。培養(yǎng)第14天時，來自肺癌患者外周血CIK細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為（86.00±5.25）%、（66.88±2.56）%、（14.90±5.79）%；臍血CIK細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為（90.68±1.77）%、（69.00±7.60）%、（20.13±3.09）%。培養(yǎng)第21天時，來自肺癌患者外周血CIK細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為（91.13±5.48）%、（70.58± 2.49）%、（14.98±5.53）%；臍血CIK細胞的CD3+細胞、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比分別為（96.83± 1.18）%、（76.15±5.78）%、（21.35±2.70）%。雖然臍血CIK細胞的CD3+、CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞百分比高于肺癌患者外周血來源的CIK細胞，但二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（CD3+細胞百分比：P=0.1348；CD3+CD8+細胞百分比：P=0.0836）；CD3+CD56+細胞百分比：P=0.1269。

圖1　CIK表型分析

2.2CIK細胞增殖實驗結(jié)果

本研究使用CCK-8染色實驗檢測CIK細胞的增殖能力，培養(yǎng)21 d的肺癌患者外周血和臍血來源的CIK細胞增殖率分別為（185.76±39.68）%、（254.32±74.60）%，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0012）。

2.3CIK細胞體外抗腫瘤活性實驗（流式細胞儀法）結(jié)果

CIK細胞與腫瘤細胞共孵育后，CIK細胞表面CD3、CD8、CD56的表達率與單獨CIK對照組相比沒有發(fā)生明顯變化。以死亡的靶細胞標(biāo)記為CFSE+PI+為依據(jù)，進一步比較來自肺癌患者和臍血的CIK細胞的抗腫瘤活性，結(jié)果表明，二者對A549和K562細胞均有抑制作用，來自臍血的CIK細胞有更強的抗腫瘤作用（圖2）。

圖2　流式檢測CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

2.4CIK細胞體外抗腫瘤活性實驗（MTT法）結(jié)果

根據(jù)公式計算來自肺癌患者外周血和臍血的CIK細胞對A549和K562細胞的體外生長抑制率，結(jié)果顯示腫瘤患者自體CIK細胞和臍血CIK細胞均有不同程度的抗腫瘤效應(yīng)且隨效靶比的升高而增加；效靶比相同時，臍血CIK細胞的體外抑瘤活性高于來自肺癌患者的CIK細胞（圖3）。

2.5檢測CIK細胞CD107a表達實驗結(jié)果

本研究通過檢測CD107a的表達來間接說明CIK細胞的細胞毒性功能，實驗結(jié)果表明，臍血CIK細胞CD107a表達高于來自肺癌患者外周血的CIK細胞（圖4）。

圖3　MTT法檢測CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

2.6檢測CIK細胞分泌的細胞因子

ELISA法檢測CIK細胞分泌的IFN-γ和TNF-α，臍血CIK和肺癌患者CIK分泌IFN-γ分別為（185.25± 30.45）pg/mL和（148.72±35.83）pg/mL，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0352）；TNF-α分別為（20.85± 4.58）pg/mL和（14.88±3.32）pg/mL，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0389）。

2.7流式檢測腫瘤細胞凋亡實驗結(jié)果

圖4　不同CIK細胞CD107a表達

本研究用Annexin V/PI雙染色檢測來自肺癌患者外周血來源的CIK細胞和臍血CIK細胞對K562細胞凋亡的影響，結(jié)果見圖5。臍血CIK細胞誘導(dǎo)的K562細胞凋亡的百分率［Annexin V+PI-細胞：（25.30± 4.87）%］高于肺癌患者的CIK細胞［Annexin V+PI-細胞：（19.87±5.41）%］，但是統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.2658）。

3　討論

細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（CIK）臨床治療惡性腫瘤的安全性和可行性已被很多基礎(chǔ)和臨床試驗確認［2-6］。CIK細胞是異質(zhì)性的細胞群體，包括 CD3+CD56+、CD3+CD56-、CD3-CD56+細胞群，其中CD3+CD56+細胞來自CD3+CD56-T細胞，主要負責(zé)非主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制性的抗腫瘤活性。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細胞是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子（包括IFN-γ、IL-2等）作用下產(chǎn)生的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群，既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞的非MHC限制性腫瘤殺傷能力，殺瘤活性高、殺瘤譜廣。

目前，對于CIK細胞大規(guī)模制備應(yīng)用和總體療效的評估已經(jīng)達成一定的共識［7，8］。本研究在前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上［9-11］，比較了來自臍血和肺癌患者外周血來源的CIK細胞體外抗腫瘤作用及機制的差異，以期為CIK細胞的臨床應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。本研究實驗結(jié)果表明，與肺癌患者CIK細胞相比，臍血來源的CIK細胞表達CD3+CD56+、CD3+CD8+的比例更高，具有明顯增強的抗腫瘤作用和增殖能力，同時伴隨增加分泌IFN-γ、TNF-α。IFN-γ能夠調(diào)節(jié)機體的免疫力，抑制病毒復(fù)制，抑制腫瘤細胞的增殖；TNF-α除能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡之外，還能夠促進細胞毒性T細胞的分化以及其他效應(yīng)因子，如IL-2、IFN-γ等的產(chǎn)生。

CIK細胞的抗腫瘤機制主要通過效靶細胞的接觸，CIK細胞表面的黏附分子，白細胞功能相關(guān)抗原-1 （leukocyte function-associated antigen-1，LFA-1）與腫瘤細胞表達的LFA-1配體結(jié)合，導(dǎo)致對腫瘤細胞的細胞毒作用；CIK細胞活化的信號通路主要涉及NK細胞受體與腫瘤細胞表達的配體的結(jié)合和被活化，最終導(dǎo)致對腫瘤細胞的脫顆粒和細胞毒性；此外，CIK細胞由Fas配體通過Fas信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［12-17］。

圖5　CIK細胞對K562細胞凋亡的影響

效-靶細胞接觸后，微管的極化運動會將溶解性顆粒運輸?shù)郊毎g的免疫突觸中。顆粒一旦到達效應(yīng)細胞的質(zhì)膜，質(zhì)膜就會溶解，顆粒即被釋放到免疫突觸中，最終導(dǎo)致靶細胞死亡［16］。CD107a（LAMP-1）、CD107b（LAMP-2）是溶酶體相關(guān)膜糖蛋白（LAMPs）。效應(yīng)細胞的脫顆粒作用導(dǎo)致細胞內(nèi)的細胞毒性顆粒膜上存在的CD107a和b暴露在細胞表面，這一過程與細胞內(nèi)穿孔素的流失相關(guān)，也與細胞內(nèi)IFN-γ的產(chǎn)生相關(guān)。因此檢測CD107a和CD107b的表達可以更全面的分析CIK細胞的功能。本研究的結(jié)果證實了臍血CIK細胞CD107a的表達高于來自肺癌患者外周血的CIK細胞。

目前流式檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)實驗和臨床研究，使用流式細胞儀可以檢測單個細胞水平的增殖，敏感性大大提高，而且結(jié)合單抗標(biāo)記可以反映不同的細胞亞群的增殖、功能和作用機制，提供的信息更為豐富，同時也大大提高工作效率。本研究的技術(shù)路線就是采用流式細胞術(shù)同時檢測臍血CIK和肺癌患者來源的CIK細胞表型、功能和腫瘤細胞的凋亡等，使實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性明顯提高。如CIK細胞的體外抗腫瘤實驗采用流式檢測和MTT法同步進行，流式細胞術(shù)所獲得的檢測結(jié)果與MTT法相比敏感性和重復(fù)性更佳。

綜上所述，本研究為臨床應(yīng)用CIK治療提供更多選擇和實驗室依據(jù)。后續(xù)的研究需要進一步比較不同來源的CIK細胞在作用機制上的差異，最終為提高臨床療效提供證據(jù)。

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▲通訊作者

［中圖分類號］R392.9；R730.2

［文獻標(biāo)識碼］A

［文章編號］1673-9701（2016）19-0038-05

收稿日期：（2016-05-26）

［基金項目］吉林省衛(wèi)生計生科研計劃（2014Z015）

Comparative study on anti-tumor effect of different sources of cytokine induced killer cells in vitro

YU HongZHANG GengyueWEI TianxueHE ChunyingLIU Yuxia
Jilin Province Cancer Prevention and Control Institute，Changchun130012，China

［Abstract］Objective To compare difference of the anti-tumor response of CIK cells from peripheral blood of patients with lung cancer and umbilical cord blood in vitro.Methods Peripheral monocytes were isolated from patients with lung cancer，and cord blood monocytes from healthy donors.Isolated cells were cultured and induced as CIK cells in vitro.The anti-tumor activities were measured by MTT assay and flow cytometry.Intracellular staining was used to test the secretion of cytokines.Results The percentage of CD3+，CD3+CD56+and CD3+CD8+cells in cord blood CIK and peripheral blood CIK of patients with lung cancer was increased with the prolongation of culture time，and there was no significant difference between the two groups；After cultured for 21 days，the proliferation rate of cord blood CIK cells and lung cancer patients'peripheral blood CIK cells was（185.76±39.68）%and（254.32±74.60）%，respectively，and there was significant difference between the two group（P=0.0012）；The anti-tumor activity of cord blood CIK cells was higher than that of lung cancer patients'peripheral blood CIK cells（effector-target ratio of 10：1，when the target cells were K562 cells P=0.0016；when the target cells were A549 cells P=0.0022）.CD107a expression in cord blood CIK cells was higher than CIK cells from the peripheral blood of patients with lung cancer（when the target cells were K562 cells，P=0.0469；when the target cells were A549 cells，P=0.0413）；Secretion levels of IFN-γ and TNF-α in cord blood CIK cells were higher than that of CIK cells from lung cancer patients（P=0.0352，P=0.0389）；The percentage of apoptotic K562 cells induced by cord blood CIK and CIK cells from lung cancer patients was（25.30±4.87）%and（19.87±5.41）%，respectively.There was no significant difference between them（P=0.2658）.Conclusion The phenotype，function and mechanism of action of CIK cells can be detected simultaneously by flow cytometry.This results can provide experimental evidence for clinical application of CIK cells.

［Key words］Cytokine-induced killer cells；Flow cytometry；Immunotherapy；CD107a