蘇宇飛，陳　鏡，王　列，文　俊

(西安市兒童醫(yī)院急診科，陜西 西安 710003)

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【臨床研究】

重癥手足口病患兒腸道菌群和腸粘膜通透性的相關(guān)研究

蘇宇飛，陳鏡，王列，文俊

(西安市兒童醫(yī)院急診科，陜西 西安 710003)

目的探討重癥手足口病患兒腸道菌群和腸粘膜通透性的變化，為臨床給予益生菌治療提供參考依據(jù)。方法選取西安市兒童醫(yī)院感染科2013年5月至2015年4月收治的重癥手足口病患兒100例作為研究組，同時隨機(jī)選取同期體檢的健康兒童50例作為對照組，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)分別檢測研究組患兒疾病初期、恢復(fù)期及對照組兒童糞便中大腸桿菌及雙歧桿菌的含量，同時分別采用改良基質(zhì)偶氮顯色法、改良鄰聯(lián)茴香胺試劑法、酶學(xué)分光光度計法檢測血液中內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)，D-乳酸水平。結(jié)果重癥手足口病患兒糞便雙歧桿菌含量在疾病初期對數(shù)值(8.79±0.58CFU/g)，顯著低于恢復(fù)期(9.26±0.98CFU/g)和正常對照組(9.29±0.86CFU/g)，F(xiàn)=3.129，P=0.048，恢復(fù)期患兒與對照組兒童雙歧桿菌含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.088，P=0.930)；疾病初期(9.20±0.84CFU/g)和恢復(fù)期(9.03±0.82CFU/g)大腸桿菌對數(shù)值均顯著高于正常對照組(7.58±0.35CFU/g)，F(xiàn)=3.707，P=0.028，疾病初期及恢復(fù)期大腸桿菌含量相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.824，P=0.413)；雙歧桿菌/大腸桿菌的比值(B/E)在疾病初期(0.96±0.24)和恢復(fù)期(1.02±0.31)均顯著低于對照組兒童(1.23±0.46)，F(xiàn)=3.254，P=0.043，疾病初期和恢復(fù)期B/E比值差別無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.877，P=0.384)；重癥手足口病患兒血液中內(nèi)毒素(0.53±0.10EU/mL)、DAO(0.08±0.02μmmol·min-1·mL-1)、D-乳酸(5.32±0.97μmmol/mL)與對照組兒童(0.48±0.09EU/mL、0.07±0.01μmmol·min-1·mL-1、4.96±0.90μmmol/mL)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.468、2.772、2.319，均P<0.05)。結(jié)論重癥手足口病患兒腸道菌群組成發(fā)生變化，大腸桿菌含量增高，疾病初期雙歧桿菌含量減少，且伴腸黏膜屏障通透性改變，臨床可應(yīng)用益生菌輔助治療。

重癥手足口?。荒c道菌群；腸粘膜屏障；益生菌

[Abstract]Objective To investigate the changes of intestinal flora and mucosal permeability in severe hand-foot-and-mouth disease (HFMD) cases, and to provide reference for clinical treatment with probiotics. Methods Totally 100 severe HFMD cases were selected in study group from infection department of Xi’an Children’ Hospital from May 2013 to April 2015, and 50 healthy children taking physical examination at the same period were selected in control group. The contents of bifidobacteria and E.coli in stool were detected by Taqman real-time PCR for patient children at early stage and recovery stage and for controls. The levels of Endotoxin, DAO and D-lactate in the serum were detected by improved chromomeric substrate azo, improved method of odianisidine agent and enzymologist spectrophotometers, respectively. Results Bifidobacterialog content at early stage of severe HFMD children (8.79±0.58CFU/g) was significantly lower than that at recovery stage (9.26±0.98CFU/g) and healthy controls (9.29±0.86CFU/g) (F=3.129,P=0.048). Cases at recovery stage were not significantly different from controls in bifidobacteria content (t=0.088,P=0.930). The contents of E. coli of cases at early stage (9.20±0.84CFU/g) and recovery stage (9.03±0.82CFU/g) were significantly higher than control group (7.58±0.35CFU/g) (F=3.707,P=0.028). The contents of E. coli at early stage was not significantly different from those at recovery stage (t=0.824,P=0.413). Bifidobacteria/E. coli ratio (B/E) at early stage (0.96±0.24) and recovery stage (1.02±0.31) were significantly lower than the control group (1.23±0.46) (F=3.254,P=0.043), and there was no significant difference in B/E ratio between early stage and recovery stage (t=0.877,P=0.384). Blood endotoxin (0.53±0.10EU/mL), DAO (0.08±0.02μmmol/min per mL), D-lactic acid (5.32±0.97μmmol/mL) in study group were significantly higher than in the control group [0.48±0.09EU/mL, 0.07±0.01μmmol/min per mL, 4.96±0.90μmmol/mL] (tvalue was 2.468, 2.772, and 2.319, respectively, allP<0.05). Conclusion Intestinal flora of children with severe HFMD change, and E. coli content increases. Bifidobacteria content decreases at the early stage, and permeability of intestinal mucosa barrier changes. Thus probiotics is recommended for adjuvant treatment.

[Key words]severe hand-foot-mouth disease; intestinal flora; intestinal mucosal barrier; probiotics

手足口病是由多種腸道病毒感染引起的小兒常見傳染性疾病，其中柯薩奇病毒A16型(CA16)和腸道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原。手足口病傳染性強(qiáng)，傳播速度快，控制難度大，很容易呈現(xiàn)爆發(fā)流行，少數(shù)重癥者可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。個別重癥患兒病情發(fā)展快，可導(dǎo)致死亡。目前手足口病尚無特效治療和預(yù)防方法，已成為嚴(yán)重威脅兒童身體健康及生命安全的主要疾病。

研究表明，腸道粘膜是病毒入侵和繁殖的主要場所[1]，腸道粘膜及其定植的腸道菌群是機(jī)體抵御病原體入侵的最重要的屏障之一。腸道菌群不僅能增強(qiáng)腸道粘膜的屏障功能，還有預(yù)防腸道感染的能力[2]；腸道致病菌與腸道益生菌之間相互制約與依賴，維持腸道內(nèi)微生態(tài)的動態(tài)平衡。腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡會造成腸上皮通透性增加從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究通過檢測重癥手足口病患兒在疾病初期及恢復(fù)期腸道內(nèi)雙歧桿菌和大腸桿菌的含量，以及腸粘膜通透性指標(biāo)的變化，探求不同時期腸道菌群及腸粘膜屏障功能的變化，旨在為完善治療方案提供依據(jù)，報道如下。

1資料與方法

1.1研究對象

研究組：入選2013年5月至2015年4月西安市兒童醫(yī)院感染科收治的重癥手足口病患兒100例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡2～5歲；②入院時病程在3天內(nèi)；③臨床確診為重癥手足口?。虎苋朐航?jīng)甘露醇降顱壓，甲潑尼龍琥珀酸鈉減輕顱內(nèi)水腫，利巴韋林抗病毒，免疫球蛋白、降溫、鎮(zhèn)靜、止驚等對癥支持治療7天后臨床治愈的患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：①危重型病例；②腦發(fā)育不良或腦損傷、先心病患兒，③近2周內(nèi)有腹瀉病史或服用益生菌制劑、抗生素者。所有病例診斷均依據(jù)衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南(2010年版)》[3]中重型手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即：精神差，出現(xiàn)嗜睡、譫妄、嘔吐、頭痛，共濟(jì)失調(diào)、肢體頻繁抖動、肌陣攣、眼球震顫、眼球運(yùn)動障礙，無力或急性遲緩性麻痹等癥狀，可出現(xiàn)腦膜刺激征、驚厥、腱反射消失或減弱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征。所有患兒腸道病毒核酸檢測均陽性。

對照組：選擇同期西安市兒童醫(yī)院兒?？企w檢的正常兒童50例。年齡2～5歲，近2周沒有腹瀉病史，并沒有使用抗生素和益生菌。

100例重癥手足口病患兒為研究對象，男60例，女40例，平均年齡3.7±1.2歲，均臨床治愈出院；同時隨機(jī)選擇同期兒?？平】刁w檢兒童50例作為對照組，其中男30例，女20例，平均年齡3.9±1.1歲。各組兒童性別、年齡比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2標(biāo)本采集

研究組患兒入院第2天清晨留取糞便作為疾病初期糞便標(biāo)本，治療1周后留取糞便作為恢復(fù)期糞便標(biāo)本，對照組兒童體檢時留取糞便標(biāo)本，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的兒童糞便標(biāo)本要求避免尿液、灰塵等污染，選擇沒有被污染的部分重量需大于1g，放置于無菌糞便收納盒中，分別做好標(biāo)記，并置于-20℃冰箱保存至糞便DNA提取。血標(biāo)本的收集是被納入研究組患兒入院次日清晨、對照組兒童體檢時空腹抽取靜脈血2～3mL至肝素抗凝管內(nèi)，然后離心機(jī)上2 000 r/min離心5min，最后提取上層血漿放到-20℃冰箱保存直至內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸檢測。

1.3研究方法

采用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測3組兒童糞便中大腸桿菌及雙歧桿菌的含量；分別采用改良基質(zhì)偶氮顯色法、改良鄰聯(lián)茴香胺試劑法和酶學(xué)分光光度計法檢測研究組及對照組兒童血液中內(nèi)毒素、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組兒童糞便雙歧桿菌與大腸桿菌含量比較

兩組兒童糞便檢測雙歧桿菌與大腸桿菌對數(shù)值差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究組患兒雙歧桿菌含量在疾病初期對數(shù)值顯著低于恢復(fù)期和正常對照組(P<0.05)，而恢復(fù)期患兒與對照組兒童雙歧桿菌含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究組患兒疾病初期和恢復(fù)期大腸桿菌對數(shù)值均顯著高于正常對照組(P<0.05)，疾病初期及恢復(fù)期大腸桿菌含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；雙歧桿菌/大腸桿菌的比值(B/E)在疾病初期和恢復(fù)期均顯著低于對照組兒童(P<0.05)，初期和恢復(fù)期B/E比值差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

注：*與恢復(fù)期組比較t=2.681，P=0.009,△與對照組比較t=0.088，P=0.930；#與恢復(fù)期組比較t=9.405，P<0.001；@與初期組比較t=0.824，P=0.413；§與恢復(fù)期組比較t=2.146，P=0.036，◇與初期組比較t=0.877，P=0.384。

2.2兩組兒童血漿內(nèi)毒素、二胺氧化酶、D-乳酸水平比較

重癥手足口病患兒疾病初期血液中內(nèi)毒素、DAO、D-乳酸含量與健康對照組兒童差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

3討論

手足口病是由多種腸道病毒感染引起的兒童常見傳染病，其傳染性強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，容易出現(xiàn)短時間內(nèi)暴發(fā)流行。該病的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。有研究報道，腸道病毒進(jìn)入消化道后在腸黏膜內(nèi)復(fù)制繁殖并持續(xù)釋放到血液，然后傳遍全身而發(fā)病，腸道黏膜是病毒入侵和增殖的主要場所[1]。人體腸道寄居著種類繁多、數(shù)量巨大的細(xì)菌群落。腸道菌群中約99%以上由乳酸桿菌、雙歧桿菌等專性厭氧菌組成，其余1%為腸桿菌科細(xì)菌為主的兼性厭氧菌[4]，主要為大腸桿菌。糞便最能體現(xiàn)腸道菌群的總體情況，正常糞便40%是微生物，活菌高達(dá)90%以上，其中專性厭氧菌(如雙歧桿菌、乳酸桿菌等)占活菌95%以上[5]。腸道正常菌群與宿主長期處于共生狀態(tài)，正常菌群一方面能維持宿主正常腸道生理功能及屏障功能，同時也能拮抗外源性致病菌的入侵與定植，維持腸道免疫平衡與穩(wěn)定，降低血氨及膽固醇等重要的生理作用。腸道屏障功能出現(xiàn)障礙，將導(dǎo)致內(nèi)毒素及細(xì)菌移位，引起各種免疫反應(yīng)及感染[6]。

3.1重癥手足口病患兒腸道菌群的變化特征

本研究通過比較重癥手足口病早期、恢復(fù)期與健康兒童腸道菌群的變化，探討重癥手足口病腸道菌群的變化特征和益生菌輔助治療的依據(jù)。研究結(jié)果顯示，重癥手足口病患兒腸道菌群構(gòu)成比例存在變化，疾病初期腸道中雙歧桿菌含量顯著低于恢復(fù)期和對照組，其原因可能是重癥手足口病初期，由于嚴(yán)重的感染破壞了胃腸粘膜循環(huán)從而導(dǎo)致腸道的缺血/缺氧誘發(fā)了腸道菌群的紊亂。由于正常菌群結(jié)構(gòu)遭到破壞，雙歧桿菌顯著減少，其生物拮抗功能消失，促使了條件治病菌和大腸桿菌過度增殖，因而重癥手足口病初期和恢復(fù)期大腸桿菌含量較對照組顯著增加；由于疾病恢復(fù)期，胃腸菌群生態(tài)未完全恢復(fù)，大腸桿菌的含量和疾病初期無顯著差別。疾病初期和恢復(fù)期的雙歧桿菌/大腸桿菌比值均低于正常對照組兒童，提示重癥手足口病患兒存在腸道菌群紊亂，同時也提示這是益生菌治療手足口病有效的原因之一。因此手足口病患兒可給予益生菌輔助治療，以維持正常的腸道菌群，防止出現(xiàn)胃腸道菌群失衡，繼而導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙，阻止病情加重。但疾病初期和恢復(fù)期雙歧桿菌/大腸桿菌比值無顯著變化，可能與樣本量少有關(guān)，需要大樣本量的臨床實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。

3.2重癥手足口病患兒腸道粘膜屏障功能的變化

血漿內(nèi)毒素水平、D-乳酸水平、DAO活性測定是用來評價腸道粘膜屏障功能的重要指標(biāo)[7]，上述指標(biāo)升高，提示腸道粘膜屏障功能受到破壞。學(xué)者楊娟檢測重癥手足口病患兒血漿內(nèi)毒素、D-乳酸及DAO水平，發(fā)現(xiàn)重癥手足口病患兒上述指標(biāo)均高于正常兒童及輕癥患兒[8]，認(rèn)為重癥手足口病患兒存在腸黏膜屏障功能的損傷，腸道毒素入血導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，患兒出現(xiàn)高熱、嘔吐及神經(jīng)系統(tǒng)的一系列臨床表現(xiàn)。本研究對上述指標(biāo)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)手足口病患兒的確存在腸粘膜通透性的明顯改變，與楊娟研究結(jié)果一致。

3.3益生菌在手足口病中的應(yīng)用研究

益生菌是指能夠?qū)λ拗鹘】诞a(chǎn)生有益作用的活的微生物。腸黏膜表層的菌膜結(jié)構(gòu)具有抗定植力的生物屏障功能，能有效阻止過路菌及外籍菌的侵襲。另外腸道益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌還通過代謝乙酸、乳酸等代謝產(chǎn)物降低腸道局部PH值，殺死沙門氏菌、大腸埃希菌等致病菌，并促進(jìn)腸道蠕動，加速細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)排出。研究顯示益生菌對兒童及成人腹瀉、慢性腸炎、泌尿系統(tǒng)疾病、肝膽疾病、過敏性疾病等具有明確的治療效果[9]。陳冰蓉等(2010年)用酪酸梭菌輔助治療兒童手足口病，發(fā)現(xiàn)患兒體溫、皰疹消失時間及食欲恢復(fù)時間均顯著縮短。魏紅娟等[4]用凝結(jié)芽孢桿菌活菌片輔助治療手足口病，觀察到患兒食欲及體溫恢復(fù)正常時間及皰疹消失及好轉(zhuǎn)時間均顯著縮短。上述研究結(jié)果一方面充分說明益生菌制劑對手足口病輔助治療的可靠效果，另一方面也充分說明手足口病患兒的確存在腸道粘膜屏障功能的障礙。

綜上所述，重癥手足口病患兒腸道菌群存在紊亂情況，表現(xiàn)為大腸桿菌等致病菌數(shù)量顯著增高，疾病初期雙歧桿菌等益生菌數(shù)量較低，同時，患兒伴隨腸道粘膜通透性改變，因此重癥手足口病患兒建議在疾病初期給予益生菌制劑，以維持腸道正常菌群，預(yù)防腸道菌群失調(diào)繼而出現(xiàn)的腸粘膜屏障功能障礙，阻止疾病惡化。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：史曉薇]

Correlation between intestinal flora and intestinal mucosal permeability in patient children with severe hand-foot-mouth disease

SU Yu-fei, CHEN Jing, WANG Lie, WEN Jun

(Department of Emergency, Xi’an Children’ Hospital, Shaanxi Xi’an 710003, China)

2015-12-14

蘇宇飛(1973-)，男，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童急危重癥的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.03.014

R725.1

A

1673-5293(2016)03-0323-03