曾麗萍,張志紅,吳素蕊,樊　建,趙天瑞,*

(1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南昆明 650223)

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人工培養(yǎng)冬蟲夏草胞外多糖的分離純化及組成分析

曾麗萍1,張志紅1,吳素蕊2,樊建1,趙天瑞1,*

(1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所,云南昆明 650223)

將冬蟲夏草菌絲體培養(yǎng)液以醇沉法提取多糖,通過DEAE-52纖維素層析柱和SephadexG-100凝膠層析柱分級純化后得到兩種單一的中性多糖組分EPS-1w和EPS-2w。應(yīng)用紫外分光光度、SephadexG-100凝膠柱層析法和比旋度法鑒定多糖的純度,凝膠過濾法、理化實(shí)驗(yàn)和高效液相色譜研究其相對分子質(zhì)量、理化性質(zhì)及組成。結(jié)果表明:EPS-1w和EPS-2w為均一組分且易溶于水、稀酸、堿,其平均分子量分別約為4.65×104u和3.48×104u,均主要是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖組成,其物質(zhì)的量比分別為23.7∶6.2∶8.5和35∶3.6∶3.1。

冬蟲夏草,多糖,分離純化,理化性質(zhì),組成分析

冬蟲夏草[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.]是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材之一,與人參、鹿茸被并稱為“中藥三寶”,具有補(bǔ)腎益氣、止咳化痰、抗疲勞、滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效[1]。冬蟲夏草是蟲草真菌寄生于蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體上形成的復(fù)合體,主要分布于青海、西藏、云南以及甘肅等海拔3000～5100 m的高寒草甸的泥土中[2]。由于受生長條件的限制較大,其資源日漸匱乏,價(jià)格也日益增高,如何有效地利用及合理地開發(fā)該藥材的活性成分成為研究學(xué)者們關(guān)注的課題。

目前,對于冬蟲夏草的活性成分研究主要集中在腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草蛋白等方面,其中,多糖作為冬蟲夏草中一種重要的活性化合物,是具有一定開發(fā)潛力的天然藥物化學(xué)成分[3]。據(jù)報(bào)道真菌多糖的藥理活性與其結(jié)構(gòu)、相對分子量等有關(guān),一般分子量大于1.6×104u的大分子組分才具有較強(qiáng)的生物活性[4]。針對于冬蟲夏草資源的稀缺,人們對其深層發(fā)酵的活性成分進(jìn)行了研究,且大量藥理、藥化及臨床應(yīng)用表明:人工蟲草菌絲體和發(fā)酵液與天然冬蟲夏草具有相似的化學(xué)成分、藥理作用和臨床療效[5]。本研究以添加一定量的吲哚乙酸(IAA)的冬蟲夏草發(fā)酵液為原料提取其胞外多糖[6],通過DEAE-52纖維素層析和SephadexG-100凝膠層析的分級純化得到EPS-1w和EPS-2w兩個(gè)中性多糖組分,并結(jié)合紫外-可見光譜分析、凝膠過濾、高效液相色譜等方法對其理化性質(zhì)和單糖的組成進(jìn)行了探討,為進(jìn)一步探究冬蟲夏草胞外多糖的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冬蟲夏草菌由昆明食用菌研究所提供;DEAE-52填料北京索萊寶科技有限公司;SephadexG-100填料北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-巖藻糖上海源葉生物科技有限公司;PMP劑(1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮)北京化學(xué)試劑公司;其余試劑均為分析純。

DEAE-52纖維素層析柱(2.6 cm×60 cm)、SephadexG-100層析柱(1.6 cm×80 cm)上海滬西儀器廠;BSZ-100A型自動部分收集器上海青浦滬西儀器廠;ZD-F12型真空冷凍干燥機(jī)南京載智自動化設(shè)備有限公司;N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海愛朗儀器有限公司;LXJ-ⅡB型大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;1260高效液相色譜分析儀美國安捷倫科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1冬蟲夏草多糖的分離純化將培養(yǎng)得到的冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液離心(5000 r/min,10 min)取上清液,減壓濃縮至原體積1/4,并加入3倍體積的乙醇溶液(95%),醇沉(4 ℃,24 h),離心(5000 r/min,10 min)取沉淀,用乙醇溶液(75%)反復(fù)洗滌2～3次,離心取沉淀,再用適量超純水溶解后凍干備用,即得發(fā)酵液粗多糖[7]。具體路線見圖1。

圖1　冬蟲夏草多糖分離純化的步驟Fig.1　Process for the separation and purification of Cordyceps sinensis polysaccharides

1.2.2冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液中多糖的分離純化

1.2.2.1DEAE-52纖維素層析柱純化取50 mg已脫除蛋白[8]的胞外多糖溶于5 mL超純水中,以4000 r/min離心10 min后將多糖溶液過0.45 μm微孔濾膜,再用滴管將過濾后的多糖溶液沿壁緩慢地加入平衡好的DEAE纖維素-52色譜柱中。分別用超純水、0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫,以1.0 mL/min流速,每管收集8 min。用苯酚-硫酸法[9]在490 nm波長下跟蹤檢測,直至檢測不到糖組分的流出,收集合并主峰的洗脫液,繪制洗脫曲線。將超純水洗脫部分濃縮后透析,冷凍干燥,備用。

1.2.2.2SephadexG-100色譜柱進(jìn)一步純化將DEAE-52纖維素柱層析分級得到的胞外多糖25 mg溶于5 mL超純水中,后用滴管將多糖溶液沿壁緩慢地加入平衡好的SephadexG-100色譜柱中,用蒸餾水以流速1.0 mL/min,每管10 min自動收集洗脫組分。用苯酚-硫酸法在490 nm波長下跟蹤檢測,直至檢測不到糖組分的流出,收集合并主峰的洗脫液,繪制洗脫曲線。收集相應(yīng)組分凍干。

1.2.3純度鑒定將經(jīng)過DEAE-52纖維素層析柱和SephadexG-100凝膠層析柱兩次逐步純化后得到多糖組分,結(jié)合紫外分光光度法、SephadexG-100凝膠柱層析法和比旋度法檢測多糖組分純度。

1.2.4分子質(zhì)量的測定[10]取5 mg藍(lán)色葡聚糖溶于適量體積的0.1 mol/L NaCl溶液中,過SephadexG-100層析柱,以0.1 mol/L NaCl溶液,洗脫速度0.2 mL/min進(jìn)行洗脫,用苯酚-硫酸法測糖含量,得外水體積V0。采用同樣條件,用已知分子量的T系列葡聚糖(T10、T40、T70、T100、T500)各5 mg過柱子,分別得到相應(yīng)的洗脫體積Ve,并根據(jù)柱直徑(1.6 cm)和凝膠柱床高度(68 cm),計(jì)算柱床體積Vt,以Kav[其中,Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)]為橫坐標(biāo),lgM為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5冬蟲夏草多糖純品理化指標(biāo)的測定將純化過的多糖通過一系列的實(shí)驗(yàn)對其溶解性[11-12](水、丙酮、甲醇、稀酸、稀堿、乙醚、二甲基亞砜、氯仿)、碘-碘化鉀反應(yīng)[13]、菲林試劑反應(yīng)[14]、三氯化鐵反應(yīng)[15]、雙縮脲反應(yīng)[16]性質(zhì)進(jìn)行研究。

1.2.6HPLC分析單糖的組成[17]稱取10 mg各種單糖標(biāo)品,將其溶于5 mL純凈水中。將單糖溶液,0.5 mol/L的PMP溶液,0.3 mol/L的NaOH溶液各吸取1 mL混勻,70 ℃衍生反應(yīng)30 min,冷卻后加入1 mL 0.3 mol/L的HCl溶液中和。加入氯仿和水各3 mL,混合搖勻,待分層后棄去氯仿層,反復(fù)萃取3次至上層水相無色為止。再將水相過0.45 μm有機(jī)濾膜,用于HPLC分析。

取多糖10 mg于安瓿瓶中,再加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液,用酒精噴燈封管后,于110 ℃水解4 h,取出后冷卻,用0.3 mol/L的NaOH溶液調(diào)至中性,定容至10 mL,5000 r/min離心10 min,分別取上清液,0.5 mol/L的PMP溶液,0.3 mol/L的NaOH溶液各1 mL混勻,于70 ℃衍生30 min,冷卻后加入1 mL 0.3 mol/L的HCl溶液中和。加入氯仿和水各3 mL,混合搖勻,待分層后棄去氯仿層,反復(fù)萃取3次至上層水相無色為止。再將水相過0.45 μm有機(jī)濾膜,用于HPLC分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理統(tǒng)計(jì)使用Oringin8.5軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1冬蟲夏草多糖的分離純化

2.1.1DEAE-52纖維素柱層析以超純水、0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫后,分別得到3個(gè)峰,收集2個(gè)較大峰,經(jīng)濃縮、透析、凍干后得白色絮狀多糖。由圖2可知,通過DEAE-52纖維素柱的分級純化,先后可洗脫出3種多糖組分,分別命名為EPS-w,EPS-1s,EPS-2s。由于DEAE-52為陰離子交換柱,因此,用超純水洗脫時(shí),中性多糖會隨超純水首先被洗脫下來,而酸性多糖將會被吸附于介質(zhì)上,需使用具有更強(qiáng)電荷性質(zhì)的NaCl溶液才能將其洗脫下來。由此可知,EPS-w為中性多糖,EPS-1s和EPS-2s為酸性多糖。據(jù)報(bào)道[18]中性多糖活性高于酸性多糖的活性,且EPS-w為冬蟲夏草胞外多糖的主要組分之一,所以選EPS-w做后續(xù)的進(jìn)一步研究。

圖2　冬蟲夏草發(fā)酵液胞外多糖DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2　The elution profile of exopolysaccharidesfrom cultured Cordyceps sinensis on DEAE-52

2.1.2SephadexG-100凝膠柱層析通過SephadexG-100凝膠柱層析對EPS-w進(jìn)一步純化。由圖3可知,通過SephadexG-100凝膠柱對EPS-w進(jìn)行純化后,先后可洗脫出2種多糖組分,分別命名為EPS-1w(管號19～40),EPS-2w(管號58～75),說明EPS-w并不是單一組分,再通過純度鑒定EPS-1w與EPS-2w是否為單一組分。

圖3　EPS-w的SephadexG-100凝膠柱層析洗脫曲線Fig.3　The elution profile of EPS-w on SephadexG-100 column chromatography

2.2EPS-1w與EPS-2w的純度鑒定

2.2.1紫外-可見光譜分析分別稱取適量的EPS-1w與EPS-2w,并配制成2 mg/mL的水溶液,用超純水調(diào)零,在190～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,由圖4可知,EPS-1w和EPS-2w在280 nm和260 nm處沒有吸收峰,說明EPS-1w和EPS-2w溶液中均不含蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì);在620 nm處沒有吸收峰,說明不含色素類物質(zhì)。

圖4　EPS-1w和EPS-2w的紫外-可見光掃描圖Fig.4　UV spectrum of EPS-1w and EPS-2w

2.2.2SephadexG-100凝膠柱層析法分別稱取EPS-1w和EPS-2w各25 mg,溶于5 mL超純水中,注入SephadexG-100凝膠柱中,用超純水進(jìn)行洗脫,采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測,繪制洗脫曲線如圖5所示。

圖5　SephadexG-100柱層析純度檢驗(yàn)圖Fig.5　SephadexG-100 column chromatography注:A、B分別表示EPS-1w和EPS-2w。

由圖5(A)、(B)可知,EPS-1w和EPS-2w均為單一對稱峰,表明EPS-1w和EPS-2w在分子量組成上也是均一的。

2.2.3比旋度法在相同條件下,用自動數(shù)顯旋光儀分別對EPS-1w和EPS-2w分級沉淀物水溶液的旋光度進(jìn)行測定,結(jié)果如表1所示。

表1　EPS-w和EPS-2w分級沉淀物的比旋光度

比旋度是均一分子量多糖的特征指數(shù)之一,其值具有唯一性[19]。因此,不同濃度乙醇沉淀出的多糖組分,如果具有相同的比旋度,那么就證明該多糖組分為均一組分。由表1可知,EPS-1w和EPS-2w在25%、50%和80%濃度乙醇的比旋光度基本相同,表明EPS-1w和EPS-2w為相對均一的多糖組分,且比旋光度為分別為+28.6 °和+35.7 °。

綜上所述,經(jīng)紫外光譜、凝膠層析法和比旋光度等方法分析表明純化后的冬蟲夏草胞外多糖組分EPS-1w和EPS-2w為相對均一多糖。

2.3EPS-1w和EPS-2w分子質(zhì)量測定分析

T系列葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示,根據(jù)EPS-1w和EPS-2w各自的洗脫體積Ve(分別為132.1、133.9 mL)代入回歸方程:y=-1.278x+5.6305(R2=0.9709)得二者的平均分子量分別約為4.65×104u和3.48×104u。這與閆景坤[20]測得的冬蟲夏草胞外多糖EPS-1A的平均分子質(zhì)量4×104u(由高效凝膠滲透色譜法測得)和龔敏[21]測得的冬蟲夏草胞外多糖CS-81002的平均分子量4.3×104u(由凝膠過濾法測得)相接近,但與于春秀[22]測得的冬蟲夏草胞外多糖EPS-1a的平均分子量4.16×105u(由凝膠過濾法測得)具有較大差別,這可能是由于冬蟲夏草多糖的提取、純化方法等因素的影響。

圖6　分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　The standard curve of mormal molecular weight

2.4理化性質(zhì)分析

通過理化實(shí)驗(yàn)分析可知,多糖EPS-1w和EPS-2w均為白色絮狀固體,無異味,易溶于水、稀酸、堿,不溶于氯仿、甲醇、二甲基亞砜、乙醚和丙酮等有機(jī)試劑,熱穩(wěn)定性良好;碘化反應(yīng)不顯藍(lán)色,表明此多糖為非淀粉類;與斐林試劑和三氯化鐵反應(yīng)均為陰性,表明不含有單糖和多酚類物質(zhì);考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)和260 nm吸收反應(yīng)均為陰性,表明可能不含有糖醛酸、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)。

2.5單糖組成

將EPS-1w和EPS-2w用TFA水解成單糖,通過PMP進(jìn)行衍生,得到的衍生物用HPLC進(jìn)行分析,結(jié)果分別如圖7、8、9所示。

圖7　單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.7　The HPLC profile of monosaccharide standards注:1,D-甘露糖;2,L-鼠李糖;3,D-葡萄糖;4,D-半乳糖;5,D-木糖;6,D-阿拉伯糖;7,D-巖藻糖；圖8、圖9同。

圖8　EPS-1w的高效液相色譜圖Fig.8　The HPLC profile of EPS-1w

圖9　EPS-2w的高效液相色譜圖Fig.9　The HPLC profile of EPS-2w

經(jīng)HPLC結(jié)果表明,EPS-1w和EPS-2w均主要由D-甘露糖、D-葡萄糖以及D-半乳糖組成,并含有少量的L-鼠李糖、D-木糖以及D-阿拉伯糖;根據(jù)各單糖衍生物的峰面積可計(jì)算出二者的D-甘露糖:D-葡萄糖:D-半乳糖分子摩爾比分別為23.7∶6.2∶8.5和35∶3.6∶3.1,EPS-2w較EPS-1w具有更高含量的D-甘露糖。由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,EPS-1w與EPS-2w的主要單糖組分,且葡萄糖的含量相對較低,這與于春秀[22]、李曉明[23]及龔敏[21]等人研究結(jié)果較為接近;但閆景坤[20]分析有所差異,其結(jié)果分析葡萄糖占比例較大。

3　結(jié)論

3.1通過DEAE-52離子交換和ScphadexG-l00凝膠過濾將醇沉法提取的冬蟲夏草發(fā)酵液中的多糖進(jìn)行分級純化,得到兩種中性多糖組分EPS-2w、EPS-1w。經(jīng)紫外光譜掃描、SephadexG-100凝膠柱層析法和比旋度法結(jié)合分析可知EPS-1w和EPS-2w都是均一多糖。

3.2通過對EPS-1w和EPS-2w的理化性質(zhì)分析,均為白色絮狀固體,無異味,且都易溶于水、稀酸、堿,不溶于氯仿、甲醇、二甲基亞砜、乙醚和丙酮等有機(jī)試劑,表明不含蛋白質(zhì)、淀粉、核酸、酚類以及還原糖,具有真菌多糖的典型性質(zhì)。

3.3經(jīng)分析EPS-1w和EPS-2w的分子量分別為4.65×104u和3.48×104u;二者的單糖組分相同,主要由D-甘露糖、D-葡萄糖以及D-半乳糖組成,并含有少量的L-鼠李糖、D-木糖以及D-阿拉伯糖;但二者的單糖分子摩爾比分別為D-甘露糖∶D-葡萄糖∶D-半乳糖=23.7∶6.2∶8.5和35∶3.6∶3.1。

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Isolation,purification and composition analysis of extracellular polysaccharide from culturedCordycepssinensis

ZENG Li-ping1,ZHANG Zhi-hong1,WU Su-rui2,FAN Jian1,ZHAO Tian-rui1,*

(1.Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply of Marketing Cooperative,Kunming 650223,China)

In the research,the polysaccharide fromCordycepssinensis’ mycelium culture had been extracted by alcohol sinking method. After been fractionated and purified with DEAE-52 cellulose column chromatography and SephadexG-100 gel column chromatograph,two neutral polysaccharides were obtained which named EPS-1w and EPS-2w. UV-spectrophotometry,SephadexG-100 gel column chromatograph method and specific optical rotation method were used to identify the purity of these two polysaccharides. And the gel filtration method and physical and chemical experiments as well as high performance liquid chromatography had been used for analyzing the polysaccharides’ relative molecular mass,physical and chemical characters and compositions. The results showed that both of EPS-1w and EPS-2w were homogeneous components,and they could be dissolved in the water,dilute acid and alkali. Their average relative molecular mass was about 4.65×104u and 3.48×104u. The EPS-1w and EPS-2w were composed by D-mannose,D-glucose,D-galactose,and the amount of substance were 23.7∶6.2∶8.5 and 35:3.6:31.

Cordycepssinensis;polysaccharide;purification;physicochemical property;composition analysis

2015-09-10

曾麗萍(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學(xué)與工程,E-mail:825767453@qq.com。

趙天瑞(1964-),男,副教授,研究方向:食品科學(xué)與工程,E-mail:food363@163.com。

國家科技支撐科技課題(2013BAD16B01)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)10-0127-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.016