陳　俊,李　婷,張　萌,翁武銀,3,*

(1.華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;2.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;3.廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

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利用鯊魚(yú)軟骨制備鈣螯合膠原肽及其性質(zhì)的研究

陳俊1,2,3,李婷2,張萌2,翁武銀2,3,*

(1.華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;2.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;3.廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

以鯊魚(yú)軟骨為原料,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化膠原肽螯合鈣的酶解制備工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶解時(shí)間、酶添加量、底物濃度分別為1 h,0.25%,25 mg/mL時(shí),制備的鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力可達(dá)1087.01 mg/100 g蛋白。制備的鈣螯合膠原肽小于5000 u的組分約占84%,天冬氨酸和谷氨酸占總氨基酸的比例為17.07%,疏水性氨基酸占總氨基酸的比例為41.24%,而必需氨基酸占總氨基酸的比例只有22.81%。根據(jù)紅外光譜和掃描電鏡結(jié)果,發(fā)現(xiàn)鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的微觀結(jié)構(gòu)均勻致密,不僅具有膠原蛋白的特征,還含有硫酸軟骨素的特征。

鯊魚(yú)軟骨,鈣螯合膠原肽,酶解,氨基酸組成,分子量分布

鈣是人體必需的常量元素,在促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和維持機(jī)體正常生理功能等方面發(fā)揮著極為重要的作用[1]。營(yíng)養(yǎng)調(diào)查表明,我國(guó)大多數(shù)人的鈣攝入水平只達(dá)到適宜攝入量的20%～60%[2]。而且,攝入的鈣不一定完全都被人體所吸收,只有在小腸中為離子狀態(tài)或與可溶性有機(jī)分子結(jié)合才容易被吸收[3-4]。因此,鈣營(yíng)養(yǎng)不足的問(wèn)題近年來(lái)逐漸引起關(guān)注。

另一方面,隨著我國(guó)魚(yú)類加工產(chǎn)業(yè)集約化程度不斷提高,魚(yú)皮、魚(yú)鱗和魚(yú)骨等副產(chǎn)物產(chǎn)量也在逐年增加,因此利用魚(yú)類加工副產(chǎn)物的蛋白資源制備具有一定生理活性的寡肽,再與鈣進(jìn)行螯合制備成膠原肽螯合鈣,不僅可以實(shí)現(xiàn)魚(yú)類資源的綜合利用,還可以為開(kāi)發(fā)補(bǔ)鈣產(chǎn)品提供新的資源。其中,骨膠原肽不僅是一種潛在的鈣源,還可以促進(jìn)人體吸收膳食中的鈣,提高人體對(duì)鈣的生物利用度,增強(qiáng)骨密度和預(yù)防骨質(zhì)疏松[5]。陸劍鋒等[6]利用斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)骨制備了膠原肽螯合鈣,并通過(guò)紫外吸收和傅里葉變換紅外光譜掃描證明了骨膠原肽與鈣形成了螯合物。與一般魚(yú)骨相比較,鯊魚(yú)軟骨脂肪含量低,富含蛋白質(zhì)、碳水化合物和無(wú)機(jī)鹽[7],主要被用于提取硫酸軟骨素。然而,有關(guān)鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的研究目前還尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此,本研究利用酶解方法,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的制備工藝,對(duì)鈣螯合膠原肽的氨基酸組成和分子量分布進(jìn)行了測(cè)定,并通過(guò)紅外光譜和掃描電鏡分析了鈣螯合膠原肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu),為鯊魚(yú)軟骨的多元化利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鯊魚(yú)軟骨龍巖市潤(rùn)寶生物科技有限公司;堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)南寧龐博生物工程有限公司;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、無(wú)水乙醇西隴化工股份有限公司;高氯酸、硝酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心;乙腈、甲醇(色譜純)美國(guó)TEDIA公司;三氟乙酸(色譜純)美國(guó)Amresco公司。

Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman公司;Thermo Solaar M6原子吸收光譜儀美國(guó)熱電公司;日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀日本日立制造所;安捷倫1200高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司;Nicolet 380傅里葉變換紅外分光光度計(jì)美國(guó)熱電公司;S-4800型掃描電子顯微鏡:日本日立制造所。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的制備將干燥的鯊魚(yú)軟骨研磨成粉,用蒸餾水溶解至一定的質(zhì)量濃度,加入堿性蛋白酶,在50 ℃、pH9.0條件下進(jìn)行酶解,酶解結(jié)束后利用沸水浴滅酶10 min并冷卻至室溫,將離心(4000 r/min、20 min)獲得上清通過(guò)冷凍干燥制備成膠原肽螯合鈣,考察酶解時(shí)間、酶添加量以及底物濃度對(duì)鈣螯合能力的影響。

1.2.1.1酶解時(shí)間的影響在酶添加量為0.5%,底物濃度50 mg/mL的條件下,考察不同酶解時(shí)間(1、2、4、6、8 h)對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響。底物濃度25 mg/mL,酶添加量0.25%。

1.2.1.2酶添加量的影響在酶解時(shí)間2 h,底物濃度50 mg/mL的條件下,考察不同酶添加量(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響。

1.2.1.3底物濃度的影響在酶添加量為0.5%,酶解時(shí)間2 h的條件下,考察不同底物濃度(25、50、75、100 mg/mL)對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響。

1.2.1.4正交實(shí)驗(yàn)以鈣螯合能力為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了鯊魚(yú)軟骨酶解的正交實(shí)驗(yàn)的各因素水平(表1),在最佳條件下獲得的樣品經(jīng)真空冷凍干燥后,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　正交因素與水平

1.2.2鈣螯合能力取一定量的鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣利用混酸(硝酸∶高氯酸=5∶1)消解2 h以上,冷卻后利用超純水定容,采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定樣品中的鈣含量,采用凱氏定氮法測(cè)定樣品中的蛋白含量,鈣的螯合能力的計(jì)算公式如下:

式中,A-樣品中的蛋白含量(g/100 g);B-樣品中的鈣含量(mg/100 g)。

1.2.3氨基酸組成稱取一定量的鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣粉末,放入可密封的消化管中,加入1 mL 6 mol/L HCl,抽真空、充氮?dú)夂?在110 ℃的條件下水解22 h,通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去鹽酸,定容稀釋至一定濃度后過(guò)0.22 μm濾膜,利用氨基酸分析儀測(cè)定螯合物中氨基酸組成。其中羥脯氨酸的含量采用羥脯氨酸試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4分子量分布鈣螯合膠原肽分子量分布的測(cè)定參考Weng等[8]報(bào)道的方法。樣品利用0.22 μm濾膜處理后,利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,并利用GPC軟件對(duì)其分子量分布進(jìn)行分析。其中測(cè)定條件:流動(dòng)相為乙腈/水/三氟乙酸(45∶55∶0.1,v/v/v),柱溫為30 °C,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。標(biāo)準(zhǔn)品為細(xì)胞色素C(12500 u)、抑肽酶(6533 u)、氧化型谷胱甘肽(613 u)、Gly-Gly-Gly(189 u)和Gly(75 u)。

1.2.5傅里葉變換紅外光譜將干燥的樣品與KBr按1∶100(w/w)的比例混合并用瑪瑙研缽研磨均勻。用壓片機(jī)壓成透明均勻的薄片后,利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描,波數(shù)為4000～400 cm-1,光譜分辨率為0.01 cm-1。

1.2.6掃描電鏡分析取適量的樣品粉末均勻涂在樣品盤(pán)的導(dǎo)電膠上,使導(dǎo)電膠表面粘結(jié)一層均勻的粉末,經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后,利用掃描電子顯微鏡對(duì)膠原肽螯合鈣的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,其中加速電壓為5 kv。

2　結(jié)果與分析

2. 1酶解工藝的優(yōu)化

2.1.1酶解時(shí)間的影響圖1顯示了酶解時(shí)間對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力逐漸降低。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí),鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力高達(dá)898 mg/100 g蛋白。當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至8 h時(shí),膠原肽的鈣螯合能力下降至359 mg/100 g蛋白。據(jù)報(bào)道,由于肽鏈中的羰基和亞氨基也可能參與金屬離子的配位,故蛋白肽與金屬離子的螯合能力可能會(huì)比氨基酸更高[9]。因此,隨著酶解的進(jìn)行,鯊魚(yú)軟骨中的膠原酶解成小分子肽、最后轉(zhuǎn)變成氨基酸,結(jié)果導(dǎo)致酶解物的鈣螯合能力逐漸下降(圖1)。這與劉玉花等[10]人報(bào)道的羊骨膠原鈣螯合肽的酶解結(jié)果類似。根據(jù)圖1的結(jié)果,選擇酶解時(shí)間為2 h進(jìn)一步研究酶添加量和底物濃度對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響。

圖1　酶解時(shí)間對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響Fig.1　Effect of hydrolysis time on the calcium-binding ability of shark cartilage collagen peptides

2.1.2酶添加量的影響伴隨著酶添加量的增加,鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力呈先上升后下降,逐漸趨于穩(wěn)定的傾向。當(dāng)酶添加量為0.50%時(shí),鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力最高,100 g蛋白可以螯合898 mg的鈣。然而,進(jìn)一步提高酶的添加量,膠原肽的鈣螯合能力卻出現(xiàn)下降,這可能是膠原蛋白被過(guò)度酶解,導(dǎo)致鈣螯合能力下降。夏松養(yǎng)等[11]也報(bào)道了隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),低值魚(yú)蛋白的水解度出現(xiàn)上升的趨勢(shì),但鈣螯合能力卻出現(xiàn)了顯著的下降。因此,選取酶添加量為0.50%。

圖2　酶添加量對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響Fig.2　Effect of enzyme dosage on the calcium-binding ability of shark cartilage collagen peptides

2.1.3底物濃度的影響當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5 mg/mL時(shí),制備的鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力為898 mg/100 g蛋白。當(dāng)進(jìn)一步提高底物濃度時(shí),鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。由于鯊魚(yú)軟骨中除了膠原蛋白,還含有大量軟骨素等多糖[7]。因此,隨著底物濃度的增加,酶解液中多糖含量也會(huì)逐漸增加導(dǎo)致溶液粘度增大,部分鈣以粘附的狀態(tài)存在于酶解液中。因此,綜合考慮,選擇底物濃度為25 mg/mL。

圖3　底物濃度對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽鈣螯合能力的影響Fig.3　Effect of substrate concentration on the calcium-binding ability of shark cartilage collagen peptides

2.1.4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析由表2可知,影響鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力的因素主次為:酶解時(shí)間>底物濃度>酶添加量,優(yōu)化結(jié)果為:酶解時(shí)間1 h,底物濃度25 mg/mL,酶添加量0.25%。在該條件下制備的鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣螯合能力高達(dá)1087.01 mg/100 g 蛋白。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的性質(zhì)分析

2.2.1氨基酸組成表3顯示了在最優(yōu)條件下利用鯊魚(yú)軟骨制備的鈣螯合膠原肽的氨基酸組成。在鈣螯合膠原肽中甘氨酸含量最多,其次是谷氨酸和脯氨酸。由表3還可以發(fā)現(xiàn)100 g鈣螯合膠原肽中總氨基酸含量為74.22 g,而游離氨基酸含量只有16.00 g,表明酶解制備的鯊魚(yú)軟骨提取物主要是由寡肽組成。有研究報(bào)道膠原肽的鈣螯合能力與某些氨基酸具有一定的相關(guān)性,天冬氨酸和谷氨酸上的羧基可能是鈣離子與肽的結(jié)合位點(diǎn)而顯著影響膠原肽的螯合能力[12]。還有研究表明小麥胚芽蛋白酶解物的疏水性氨基酸含量與其鈣螯合能力具有正相關(guān)關(guān)系[13]。在本研究制備的鈣螯合膠原肽中,天冬氨酸和谷氨酸含量占總氨基酸含量的17.07%,而疏水性氨基酸含量卻高達(dá)41.24%,表明鯊魚(yú)軟骨可作為制備膠原肽螯合鈣的良好原料。然而,100 g鈣螯合膠原肽中必需氨基酸含量只有16.93 g,約占總氨基酸含量的22.81%,明顯低于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(40%)。

表3　鯊魚(yú)軟骨制備的鈣螯合膠原肽的氨基酸組成

注:* 表示氨基酸為疏水性氨基酸。

2.2.2分子量分布為進(jìn)一步了解鯊魚(yú)軟骨膠原肽的鈣結(jié)合能力與其分子量的關(guān)系,利用高效液相凝膠色譜對(duì)最優(yōu)條件下制備的鈣螯合膠原肽的分子量分布進(jìn)行分析(圖4)。由圖可知,利用鯊魚(yú)軟骨制備的鈣螯合膠原肽的分子量主要分布在1000～5000 u。Jin等[14]研究發(fā)現(xiàn),分子量小于5000 u的牛骨膠原多肽具有較好的鈣結(jié)合能力。利用GPC軟件對(duì)分子量分布進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)本研究制備的鈣螯合膠原肽中小于5000 u的組分高達(dá)84%。

圖4　鯊魚(yú)軟骨制備的鈣螯合膠原肽的分子量分布Fig.4　Molecular weight distribution profile of calcium-chelating collagen peptides from shark cartilage

2.2.3傅里葉變換紅外光譜鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣在3345.9、1653.8、1397.9 cm-1處出現(xiàn)明顯的特征吸收峰(圖5),分別代表了N-H的伸縮振動(dòng)、C=O的伸縮振動(dòng)和-COO-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)[15-16];同時(shí)在代表C-O伸縮振動(dòng)的1244.4 cm-1處也出現(xiàn)明顯的吸收峰,這些結(jié)果表明鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣中含有-NH2和-COOH結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道,中華鱘軟骨中的硫酸軟骨素在1069.1 cm-1處具有吸收峰,為糖環(huán)C-O-C和C-O-H的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰[17]。圖5的1070.1 cm-1處觀察到的吸收峰表明了本研究制備的鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣中也可能含有硫酸軟骨素。

圖5　鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣紅外光譜圖Fig.5　FTIR spectra of collagen peptide chelating calcium from shark cartilage

2.2.4微觀結(jié)構(gòu)利用掃描電子顯微鏡對(duì)鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察(圖6)。鯊魚(yú)軟骨經(jīng)酶解后獲得的膠原肽螯合鈣的結(jié)構(gòu)均致密。劉閃等[18]利用白鰱骨膠原肽與無(wú)機(jī)鈣進(jìn)行結(jié)合制備膠原肽螯合鈣,電鏡掃描圖譜顯示在膠原肽螯合鈣的表面鑲嵌有CaCl2晶體。然而在本研究中未觀察到附著于膠原肽表面的白色晶體,這可能是鯊魚(yú)軟骨在酶解過(guò)程中,天然的鈣能夠均勻的螯合在膠原肽上,不容易形成晶體。

圖6　鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣電鏡掃描圖譜(×25000)Fig.6　Scanning electron micrographs of collagen peptide chelating calcium from shark cartilage(×25000)

3　結(jié)論

以鈣螯合能力為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得鯊魚(yú)軟骨膠原肽螯合鈣的最佳制備工藝。制備的鈣螯合膠原肽的分子量主要集中在5000 u以下,氨基酸組成中天冬氨酸和谷氨酸,以及疏水性氨基酸占總氨基酸的比例較高,提示制備的鯊魚(yú)軟骨膠原肽具有良好的鈣螯合能力。紅外光譜圖和掃描電鏡圖譜的結(jié)果表明鯊魚(yú)軟骨通過(guò)酶解可以獲得均勻致密的膠原肽鈣螯合物。

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Preparation and characterization of calcium-chelating collagen peptides from blue shark(Prionaceglauca)cartilage

CHEN Jun1,2,3,LI Ting2,ZHANG Meng2,WENG Wu-yin2,3,*

(1.College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Xiamen 361021,China;2.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;3.Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food,Xiamen 361021,China)

The optimum enzymolysis condition of calcium-chelating collagen peptides from blue shark cartilage was investigated by single factor test and orthogonal test. The maximum calcium-chelating ability(1087.01 mg/100 g protein)was obtained at hydrolysis time of 1 h,enzyme dosage of 0.25% and substrate concentration of 25 mg/mL. In the obtained collagen peptides,about 84% component was distributed with molecular weight below 5000 u,the content of glutamic acid and aspartic acid,and the content of hydrophobic amino acids were 17.07% and 41.24%,respectively. However,the ratio of essential amino acids to total amino acids was 22.81%. Based on results of fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)and scanning electron microscope(SEM),it was found that the microstructure of calcium-chelating collagen peptides,which not only had the characteristics of collagen but also contained chondroitin sulfate,was uniform compact.

shark cartilage;calcium-chelating collagen peptides;enzymatic hydrolysis;amino acid composition;molecular weight distribution

2015-12-14

陳俊(1977-)，男，博士研究生，副教授，主要從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用研究，E-mail：chenjun@jmu.edu.cn。

翁武銀(1974-)，男，博士，教授，主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)和水產(chǎn)加工研究,E-mail：wwymail@jmu.edu.cn。

福建省杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J06013)；福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Y0081)；廈門(mén)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20131152)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)11-0053-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.002