石山慧 呂定超 翟旭雯 李端端 周密 左琳

基礎(chǔ)研究

改良成年小鼠心室肌細(xì)胞分離方法

石山慧 呂定超 翟旭雯 李端端 周密 左琳

目的 改進(jìn)小鼠成體心肌細(xì)胞的分離方法，以提高小鼠心室肌細(xì)胞的成活率和收獲量。方法

采用心臟在體主動(dòng)脈插管，行獨(dú)創(chuàng)的前加壓灌流法沖洗心臟后接入改進(jìn)的langendorff裝置，用膠原酶液Ⅱ灌流、消化心臟后，將心臟剪碎并用吸管吹打，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后獲得單個(gè)小鼠心室肌細(xì)胞。檢測(cè)并對(duì)比在體和離體主動(dòng)脈插管獲得的心肌細(xì)胞的狀態(tài)：梯度復(fù)鈣后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和桿狀心室肌細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果 研究結(jié)果顯示，改良的主動(dòng)脈逆行灌流法在縮短手術(shù)時(shí)間的同時(shí)，提高了小鼠心室肌細(xì)胞收獲量和存活率。本課題組利用醫(yī)用三通管，獨(dú)創(chuàng)倒置灌流排氣法，可以迅速排空灌流裝置中的氣體；利用注射器和灌流針結(jié)合，獨(dú)創(chuàng)前加壓灌流法，可以快速?gòu)氐椎貨_洗心臟中的血液；并采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)眼科鑷和血管鉗巧妙組合成協(xié)助裝置，可以單人獨(dú)立完成插管，不需要助手協(xié)助，節(jié)約人力，節(jié)省經(jīng)費(fèi)開支。結(jié)論成年小鼠心室肌細(xì)胞分離方法的改進(jìn)使整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)化，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，操作簡(jiǎn)便易學(xué)；同時(shí)該分離方法穩(wěn)定、可靠、有效，可以為同類型實(shí)驗(yàn)提供思路和借鑒。

成年小鼠；心室肌細(xì)胞；分離；Langendorff；膠原酶

缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy，ICM）是指由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起心肌缺血、纖維化，進(jìn)而產(chǎn)生與原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病類似的臨床綜合征。WTO組織報(bào)道：目前ICM已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手[1]。ICM發(fā)病過程中，大量心室肌細(xì)胞缺血壞死是導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能改變的主要原因。因此，針對(duì)如何減少心室肌細(xì)胞死亡是缺血性心肌病防治的核心。

在ICM研究中常用到的細(xì)胞類型有乳鼠心肌細(xì)胞、H9C2等細(xì)胞類型，和以上細(xì)胞相比，成年鼠心室肌細(xì)胞（ventricular cardiomyoctyes，VCMs）在結(jié)構(gòu)和功能上更接近在體的真實(shí)狀況，因而被廣泛用于ICM的病理生理學(xué)研究，同時(shí)它也是藥物干預(yù)的良好細(xì)胞材料[2-4]。但是，成年小鼠VCMs的分離和培養(yǎng)一直是該領(lǐng)域的技術(shù)難點(diǎn)。經(jīng)典的心肌細(xì)胞分離方法是將心臟取出后掛于langendorrf灌流裝置上，先用無鈣臺(tái)氏液灌流心臟，然后用膠原酶Ⅱ進(jìn)一步酶解消化心臟，分離得到VCMs[3,5]。該經(jīng)典方法多適用于兔子、大鼠和豚鼠等中等大小的物種[6,7]，而對(duì)于小鼠VCMs的分離，目前主要有以下三個(gè)技術(shù)難題：小鼠心臟小，手術(shù)難度高；手術(shù)需助手協(xié)助：灌流裝置不易排氣。

針對(duì)以上問題，我們對(duì)該經(jīng)典分離方法進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)Langendorff灌流裝置行倒置灌流排氣法，同時(shí)采用在體主動(dòng)脈插管和前加壓灌流法對(duì)心臟進(jìn)行沖灌、酶解，急性分離成年小鼠心室肌細(xì)胞。方法改進(jìn)使細(xì)胞分離實(shí)現(xiàn)了單人操作，同時(shí)大大縮短了心臟離體灌流的操作時(shí)間，提高了細(xì)胞存活率，為小鼠心室肌細(xì)胞的分離提供了新的思路和經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用C57/BL6小鼠，8～10周齡，雌雄均可，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置遵循山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 CollagenaseⅡ（Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，USA）、Taurine（Sigma，USA）、Albumin Bovine Ⅴ （Roche Molecular Biochemicals，Mannheimm，Germany），laminin （Sigma，USA）。

1.1.3 主要儀器 langendorff灌流裝置，酸度計(jì)，倒置顯微鏡，恒溫水浴箱，微量蠕動(dòng)泵。

1.1.4 試劑：pH 7.38。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的麻醉及心臟暴露 用1.5%戊巴比妥鈉0.1 ml/20 g對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔麻醉后，仰臥位固定小鼠四肢，碘伏棉球消毒胸腹部皮毛（圖1A），打開腹腔，貼近腹后壁尋找腹主動(dòng)脈（圖1B），行腹主動(dòng)脈放血（圖1C）。

用手術(shù)剪將劍突處皮毛剪一小口，然后換眼科剪，分別沿著左右肋弓下緣剪至兩側(cè)腋后線處，再沿著胸骨柄中間剪皮毛至鎖骨下窩，呈倒T字型（圖1D），并將皮毛向上掀起充分暴露手術(shù)視野。然后換另一套無菌手術(shù)器械，用手術(shù)剪在劍突上方約0.5 cm處剪胸骨一小切口（圖1E），再分別沿著左右肋骨下緣剪至腋后線的位置，沿著胸骨柄中間剪至胸骨窩邊緣，將胸壁剪成倒T字型（注：不要?jiǎng)澠齐跫”┞陡骨粌?nèi)容物而產(chǎn)生不必要的污染）（圖1F），然后沿著胸骨柄中間剪至鎖骨下窩，接著分別沿腋后線向上剪至腋窩，將整個(gè)胸壁摘下（圖1G）暴露胸腔（圖1H）。

1.2.2 在體主動(dòng)脈插管 剪開心包膜，去除覆蓋在心臟上方的胸腺（圖2A），充分暴露胸腺下方的血管叢。從鼠體右到左依次是上腔靜脈、主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈干（圖2B），找到位于中間的顏色鮮紅、彈性較大的主動(dòng)脈，在離心底上方約0.5 cm處插眼科鑷的一端于主動(dòng)脈下方，用于夾持主動(dòng)脈并協(xié)助灌流針插管（圖2C）。然后用顯微解剖鑷穿6號(hào)手術(shù)線于主動(dòng)脈弓下方（圖2D），用眼科剪在主動(dòng)脈弓分叉處剪一小切口，大約是主動(dòng)脈管徑的1/3～1/2，切口緊靠主動(dòng)脈弓距心底約3 mm（圖2E），左手持顯微解剖鑷準(zhǔn)確夾持主動(dòng)脈斷端的一側(cè)血管壁（圖2F），右手持灌流針管，在心臟舒張期，迅速將灌流針插入主動(dòng)脈腔內(nèi)，適當(dāng)調(diào)整位置之后，用眼科鑷夾住插管（圖2G），同時(shí)用血管鉗鉗住眼科鑷的中間位置，防止插管移位，便于單人操作（圖2H），然后迅速結(jié)扎主動(dòng)脈，撤去眼科鑷（圖2I），提起心臟，剪斷心臟相連的主動(dòng)脈及其下方的結(jié)締組織，游離出心臟（圖 2J、K、L）。

1.2.3 離體心臟冠狀動(dòng)脈逆行灌流 將裝有Solution 1的注射器和連有心臟的灌流針頭組合，構(gòu)成前加壓灌流裝置，適度按壓注射器進(jìn)行前加壓冠脈逆行灌流，會(huì)發(fā)現(xiàn)心臟迅速充盈并伴有血液流出，心臟顏色由深紅色變?yōu)榉奂t色直至呈粉白色（圖3A、B、C），灌流流出液顏色逐漸變清直至澄清無肉眼下混濁（圖 3D、E），約需要 Solution 1 10 ml，沖洗時(shí)間1.0 min（注：勿將空氣灌流入心臟產(chǎn)生氣體栓塞，圖3B）。將Langendorff灌流裝置預(yù)處理后，采用倒置灌流排氣法灌入Solution 2，確保無氣泡后調(diào)流速約4 ml/min，將連有心臟的灌流針頭接入Langendorff灌流裝置，用酶解消化液灌流約8 min，至心臟呈微透明狀，此時(shí)心臟質(zhì)地軟如嘴唇，停止灌流剪下心臟。

將消化好的心室置于5 ml預(yù)熱的Solution 3中，用顯微鑷撕成小碎塊，用1 ml槍頭吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，加25 ml Solution 4吹打成細(xì)胞懸浮液，500 r/min，離心1 min，棄上清，再用25 ml Solution 5自然沉淀細(xì)胞10 min，棄上清；加適量Solution 5重懸細(xì)胞，將細(xì)胞滴加于載玻片上，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)[8,9]并計(jì)數(shù)，采用XB-K-25細(xì)胞計(jì)數(shù)板，取左上、右上、左下、右下和中間的中格的細(xì)胞，5個(gè)格的細(xì)胞總數(shù)記為N，計(jì)算公式：5N×104×5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，兩組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種插管法平均插管時(shí)間比較 通過比較在體插管法和離體插管法的優(yōu)劣，我們發(fā)現(xiàn)，從平均插管時(shí)間來看，在體插管法的平均插管時(shí)間明顯短于離體插管法［（88.0±10.5）s比（245.0±27.0）s，P＜0.01，n=10，見圖4］。以上結(jié)果提示，改良方法顯著縮短插管時(shí)間，這一時(shí)間的縮短可以明顯減輕心肌細(xì)胞缺氧損傷，有助于提高其存活率。

2.2 兩種插管法的平均細(xì)胞收獲量比較 我們將兩種方法急性分離出來的心室肌細(xì)胞懸液，分別滴加在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，測(cè)定不同方法的心室肌細(xì)胞收獲量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體插管法的細(xì)胞收獲量高于離體插管法［（6.10±0.27）×106比（4.60±0.19）×106，P＜0.01，n=6，見圖 5］。

2.3 兩種插管法分離的心室肌細(xì)胞存活率比較 急性分離的小鼠心室肌細(xì)胞37℃孵箱貼壁培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌3×5 min后，鏡下計(jì)數(shù)存活細(xì)胞數(shù)，和前一天種植的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，計(jì)算細(xì)胞存活率。每個(gè)標(biāo)本分別觀察3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)觀察10個(gè)100倍視野下活細(xì)胞的數(shù)目?；钚院玫男氖壹〖?xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，條紋清晰；活性差的心室肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)；死亡的心室肌細(xì)胞呈圓團(tuán)狀，絮狀皺縮在一起。因此，從細(xì)胞形態(tài)上可以直接分辨出心室肌細(xì)胞的狀態(tài)，如圖6。結(jié)果表明，在體插管法的細(xì)胞存活率明顯高于離體插管法［（58.40±10.92）%比 （38.10±10.74）%，P＜0.01，n=10）］，說明在體插管法可以保持較高的細(xì)胞活性。

3 討論

快速大量地分離心肌細(xì)胞及保持心肌細(xì)胞較高的活性是成年小鼠心肌細(xì)胞分離技術(shù)的兩個(gè)重點(diǎn)，而易操作性和可行性是實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)重要目標(biāo)的保障。目前該技術(shù)主要有以下三個(gè)難題：①小鼠的主動(dòng)脈管徑小且易閉合，離體難以尋找和定位，手術(shù)操作難度較大。②離體主動(dòng)脈插管需要助手或者其他裝置協(xié)助，不能單人獨(dú)立完成。③Langendorff裝置的內(nèi)管是螺旋管，這一改進(jìn)增加了液體恒溫水浴的接觸面積，但該系統(tǒng)不易排氣泡，而且先后用無鈣臺(tái)式液和膠原酶Ⅱ灌流心臟時(shí)容易出現(xiàn)兩種液體的混合，以及灌流系統(tǒng)中極易進(jìn)入氣泡，同時(shí)臺(tái)式液灌流時(shí)間不宜控制。針對(duì)以上問題，本研究做了如下改進(jìn)。

第一，本研究用在體主動(dòng)脈插管法代替了經(jīng)典的離體主動(dòng)脈插管法。因小鼠心臟小如黃豆，主動(dòng)脈直徑一般小于1 mm，且離體后會(huì)收縮乃至閉合。同時(shí)缺血的主動(dòng)脈和周圍靜脈脂肪組織的顏色相似，均為白色，難以尋找和定位，離體插管難度大。而在體主動(dòng)脈充盈程度好，位于三根主血管中間，易尋找和定位，幾乎不會(huì)發(fā)生主動(dòng)脈定位不準(zhǔn)確所導(dǎo)致的插管錯(cuò)誤。同時(shí)，插管深度也是影響灌流效果的主要因素。插管前首先在主動(dòng)脈弓處剪一個(gè)微小切口，便于無針尖的灌流針插入。在心臟舒張期將灌流針迅速插入主動(dòng)脈，將灌流針頭調(diào)整至主動(dòng)脈和左右冠脈交界處，結(jié)扎后完成主動(dòng)脈插管，手術(shù)難度小，易學(xué)習(xí)，掌握快。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)的同一個(gè)實(shí)驗(yàn)者同時(shí)采用兩種方法進(jìn)行主動(dòng)脈插管并對(duì)比所用時(shí)間，在體插管組比離體插管組節(jié)約2 min，因?yàn)樵隗w插管易定位主動(dòng)脈位置，所以插管時(shí)間大大縮短，心臟離體且未灌流的時(shí)間越短，越易保持心臟功能，同時(shí)在一定程度上可保持心室肌細(xì)胞的活性。在改良的主動(dòng)脈插管過程中，我們又創(chuàng)新性地將眼科鑷和止血鉗相結(jié)合，不需要支架及助手協(xié)助插管[10]，巧妙地運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室常見的器械實(shí)現(xiàn)單人插管，既避免額外購(gòu)置多余儀器，節(jié)減經(jīng)費(fèi)開支，又節(jié)約了人力。

第二，前加壓灌流沖洗心臟中血液具有一定優(yōu)勢(shì)。經(jīng)典分離小鼠心室肌細(xì)胞常用的Langendorff灌流系統(tǒng)采用的是恒壓灌流，由于高度和管徑的限制，這種灌流方法需要大量的灌流液，同時(shí)在酶液的回收和循環(huán)利用上有一定的浪費(fèi)。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中將該Langendorff灌流系統(tǒng)和微量蠕動(dòng)泵相連，改為恒流灌流系統(tǒng)。傳統(tǒng)的恒壓灌流需要先用無鈣臺(tái)約15 ml沖洗心臟中積血約4 min。我們將灌流針和10 ml注射器巧妙結(jié)合起來，能在1 min內(nèi)將心臟中的血液沖洗干凈。此前加壓冠脈逆行灌流法操作簡(jiǎn)單，心臟沖洗充分，同時(shí)也縮短了心臟離體缺氧的時(shí)間。

第三，Langendorff逆行灌流排氣法。Langendorff裝置通常不易排盡氣泡，氣泡的殘留對(duì)于灌流會(huì)產(chǎn)生一定的影響。通過方法的改進(jìn)，我們?cè)诠嗔鞴艿南露搜b一個(gè)三通管，從這個(gè)三通管逆行灌入酶液。該設(shè)計(jì)能迅速排凈灌流管中的氣泡。該排氣方法簡(jiǎn)單有效而實(shí)用，避免了Langendorff灌流系統(tǒng)排氣困難和排氣耗時(shí)過長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響。

通過在體主動(dòng)脈插管成功分離心肌細(xì)胞后，我們?cè)?00倍倒置顯微鏡下觀察了心室肌細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在體插管法獲得的心室肌細(xì)胞活性較好，同時(shí)細(xì)胞收獲量也高于傳統(tǒng)方法。此外，該手術(shù)方法也適用于分離成年小鼠心房肌細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞及心臟干細(xì)胞，可以為后續(xù)的心臟組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)提供基礎(chǔ)技術(shù)性支持。經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)摸索，本課題組得到以下經(jīng)驗(yàn)：①準(zhǔn)確的主動(dòng)脈插管位置，灌流針管的末端需位于冠狀動(dòng)脈開口處；②將連有心臟的灌流針接入灌流裝置時(shí)應(yīng)排盡空氣；③開胸之前腹主動(dòng)脈提前放血，防止插管過程中血液凝固堵塞微小血管，灌流沖洗心臟不充分；④酶解過程中一定控制酶解時(shí)間，左右偏離時(shí)間盡量不要超過30 s；⑤吹打心肌細(xì)胞之前將吸管頂部剪短，用力輕柔或者不用吸管吹打，只需輕輕搖晃盛有心肌組織的EP管，上下顛倒幾次即可；⑥實(shí)驗(yàn)室溫度要在25℃以上，可以避免低溫導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞低活性率。本研究采用詳細(xì)的圖示介紹了在體主動(dòng)脈分離技術(shù)的具體步驟和注意事項(xiàng)，對(duì)心肌細(xì)胞分離技術(shù)的初學(xué)者有很大幫助和啟迪。

圖1 暴露心臟

圖2 在體主動(dòng)脈插管

圖3 Lagendorff逆行灌流分離單個(gè)心室肌細(xì)胞

圖4 在體插管法與離體插管法的插管時(shí)間對(duì)比

圖5 在體插管法與離體插管法的細(xì)胞收獲量對(duì)比

圖6 心室肌細(xì)胞存活率的比較

［1］Lloyd-Jones D，Adams RJ，Brown TM，et al.Heart Disease and Stroke Statistics——2010 Update：A Report From the American Heart Association.Circulation，2010，121：e46-215.

［2］Kruppenbacher JP，May T，Eggers HJ，et al.Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture.Naturwissenschaften，1993，80：132-134.

［3］Wolska BM，Solaro RJ.Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.Am J Physiol，1996，271：H1250-1255.

［4］Sambrano GR，F(xiàn)raser I，Han H，et al.Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.Nature，2002，420：712-714..

［5］Zhou YY，Wang SQ，Zhu WZ，et al.Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes：methods for cellular genetic physiology.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，279：H429-H436.

［6］Mitra R，Morad M.A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.Am J Physiol，1985，249：H1056-1060.

［7］Powell T.The isolation and characterization of calcium-tolerant myocytes.Basic Res Cardiol，1984，80：15-18.

［8］Kabaeva Z，Zhao M，Michele DE.Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294：H1667-1674.

［9］Kohncke C，Lisewski U，Schleubner L，et al.Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.J Vis Exp，2013，12：e50145.

［10］Smith AJ，LewisFC，Aquila I，etal.Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.Nat Protoc，2014，9：1662-1681.

The improvement of adult mouse cardiomyocytes isolation method

SHI Shan-hui，Lü Ding-chao，ZHAI Xu-wen，et al.Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

ZUO Lin，E-mail：zuol1505@126.com

Objective The mouse is a better experimental animal suitable for genetic study.In order to increase the harvest and survival rate of adult mouse ventricular cardiomyoctyes AMVCMs，we try to improve the isolation method.Methods In the experiment，we used aortic cannulation in vivo and high-pressure perfusion to flush the heart，then collagenaseⅡ was used to digest the heart by the Langendorff apparatus.Hereafter the fully digestion，the atria of the heart was removed.The remainder of the heart was minced.After repeated pipetting，cell suspension was filtered with 200 μm nylon net，AMVCMs can be collected.The research has compared the amount and quality of AMVCMs between aortic cannulation in vivo and in vitro method after gradient calcium reintroduction.Results The result showed that the improved aortic cannulation method can shorten the operation time and increase the harvest and survival rate of AMVCMs.Our group original create the function of inverted exhaust by using an medical three-way pipe to remove all traces of the bubble in the perfusion apparatus；create pre-perfusion method by combining the syringe and perfusion needle to wash the heart rapidly and thoroughly；combine ophthalmology tweezers and forceps into an equipment to assist to realize cannulation by single person with saving resources and fund.Conclusion The improvements can simplify the whole experimental procedure，shorten the isolation time which is easy to learn.The improved method is stable，reliable and effective which can provide ideas for similar experiments.

Adult mice；Ventricular cardiomyocytes；Isolation；Langendorff；Collagenase

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81200120）；山西省留學(xué)回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2014-036）

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系

左琳，E-mail:zuol1505@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.019

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2016）08-0748-04

2016-02-12）