張海燕,柳陳堅,劉祥祥,羅義勇,李曉然

(昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院,云南昆明 650500)

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基于高通量測序分析老面細菌多樣性

張海燕,柳陳堅+,劉祥祥,羅義勇,李曉然*

(昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院,云南昆明 650500)

老面中微生物組成多樣，帶來多種微生物的發(fā)酵產(chǎn)物及風味，分析老面中細菌群落多樣性對于開發(fā)優(yōu)良面食發(fā)酵劑提供有用信息。本研究采用基于16S rDNA的焦磷酸測序方法分析了采集自云南省香格里拉縣的三個老面樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，三個樣品細菌多樣性都比較高，17年和2年老面中，優(yōu)勢菌是Lactobacillussanfranciscensis，2年老面中含有少數(shù)序列與L.rossiae和L.plantarum具有較高的相似性，而5年老面中優(yōu)勢菌是Staphylococcusequorum，其次是L.sanfranciscensis。結(jié)論：老面中細菌多樣性較高，以乳酸菌為主，其中的乳酸桿菌為老面發(fā)酵面食帶來豐富的營養(yǎng)和風味物質(zhì)，但是較高豐度葡萄球菌屬的檢出，暗示了一定的食品安全隱患。

老面,細菌群落,焦磷酸測序,多樣性

老面是制作發(fā)酵面食的發(fā)酵劑,將水和面粉等原料按一定的比例混合,自然發(fā)酵而成,每次發(fā)酵后保留部分面團作為下次發(fā)酵的發(fā)酵劑。比起市售的單一酵母發(fā)酵劑,老面發(fā)揮了多菌種混合發(fā)酵的優(yōu)勢,多種微生物混合發(fā)酵改善了面食中的營養(yǎng)成分,生成醇、脂、醛、酚等多種風味物質(zhì)[1]。采用老面發(fā)酵蒸制出的饅頭、包子等面食,質(zhì)構(gòu)松軟,香甜可口,風味獨特,深受消費者喜愛。

工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵面食主要采用單一酵母發(fā)酵劑和泡打粉等食品添加劑制作而成。老面中的微生物主要是乳酸菌和酵母菌,乳酸菌在面團發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機酸等物質(zhì)決定發(fā)酵面食的口感和風味,同時有機酸可以抑制病原微生物生長,延長發(fā)酵面食的保質(zhì)期。以前對老面微生物的研究大多采用富集分離純培養(yǎng)與鑒定的方法[2-3],雖然也獲得了一些有用的信息,但是通過培養(yǎng)方法僅能得到樣品中少部分微生物信息,給充分發(fā)掘與利用傳統(tǒng)發(fā)酵劑菌種資源帶來一定困難?；赑CR的分子生物學方法對依賴培養(yǎng)的技術(shù)進行了補充,隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展,能夠得到更多的序列信息,極大地促進了對復雜微生物群落多樣性的研究[4]。

老面中的微生物菌群結(jié)構(gòu)是保障發(fā)酵面食產(chǎn)品質(zhì)量的前提與基礎(chǔ),其中除了市售發(fā)酵劑提供的酵母外,乳酸菌也起到極為重要的作用,因此,本研究旨在分析老面中細菌群落結(jié)構(gòu),明確其中的益生菌及潛在致病菌。本研究以云南省迪慶州香格里拉縣三個不同年份的老面為研究對象,分別為持續(xù)使用17年、5年和2年的老面樣品,采用焦磷酸高通量測序的方法對三個老面樣品中的細菌群落多樣性進行研究,以期為傳統(tǒng)發(fā)酵面食安全提供有利的信息,為篩選出適合作為面食發(fā)酵劑的優(yōu)良菌株組合提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗用的老面樣品分別購于云南省迪慶自治州香格里拉縣農(nóng)貿(mào)市場的三個不同的商鋪,均為自然發(fā)酵老面,購買后分別裝入無菌采集袋中,置于便攜式冰箱中運送至實驗室,并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。三個老面分別為反復使用17年、5年和2年的老面樣品,即每次制作發(fā)酵面食后留下一些發(fā)酵面團作為下一次面食的發(fā)酵劑,如此反復使用,分別命名為LM17,LM5,以及LM2。

DNA提取裂解緩沖液:0.1 mol/L Tris/HCl,0.1 mol/L EDTA,0.75 mol/L蔗糖;TE緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0);Premix Ex TaqTM大連TaKaRa公司。

DNA純化回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit德國Qiangen;Sigma 3-18K離心機美國Sigma公司;Labnet 230V EU渦旋儀美國labnet公司;ABI 7200PCR儀美國ABI公司;Nanodrop ND-1000分光光度計美國Thermo公司;羅氏GS-FLX測序儀瑞士Roche公司。

1.2實驗方法

1.2.1DNA提取DNA提取參考Schmidt等[5]的方法并做了適當?shù)男薷?。為了較為全面地分析樣品中的微生物,對樣品采用直接提取DNA的方法。在實驗室無菌操作臺上,各采集5份老面表面(不同部位)和5份內(nèi)部(不同部位)的樣品,樣品混勻后,取約0.2 g老面樣品于2.0 mL的離心管中(為增加得到的DNA量,DNA提取在多個離心管中進行,最后混合),加入450 μL裂解緩沖液和10 μL 50 mg/mL溶菌酶,37 ℃水浴30 min。往離心管中加入25 μL 20% SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K,震蕩混勻后,55 ℃水浴2 h以上。隨后加入80 μL 5 mol/L NaCl和60 μL 10% CTAB/NaCl,小心混勻后,65 ℃水浴20 min。加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1,體積比),約700 μL,顛倒混勻后,12000 r/min離心10 min。小心取上清至新的1.5 mL離心管中,加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1,體積比),顛倒混勻后,12000 r/min離心10 min。小心取上清至新的1.5 mL離心管中,加0.6倍體積的異丙醇,-20 ℃沉淀過夜。隨后,12000 r/min離心15 min,棄上清,加500 μL 70%乙醇(-20 ℃預(yù)冷)洗滌沉淀,12000 r/min離心15 min,棄上清,65 ℃烘干30 min(每隔10 min輕彈管壁,以促進液體揮發(fā)),最后,加40 μL TE緩沖液溶解DNA,并將其于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細菌16S rDNA擴增和焦磷酸測序使用16S rDNA通用引物338F(5′-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3′)和907R(5′-CCG TCA ATT CMTTTG AGT TT-3′)對細菌DNA的V3-V5高變區(qū)進行擴增。為了減少PCR過程中產(chǎn)生過多的非特異性擴增的異源雙鏈DNA,將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板后按照原來的條件再做5個循環(huán)[6]。PCR擴增采用Premix Ex TaqTM(大連TaKaRa公司),具體體系及程序如下:

PCR反應(yīng)體系:ddH2O 18 μL;Forward引物(5 μmol/L)2 μL;Reverse引物(5 μmol/L)2 μL;25 μL Premix Ex TaqTM;模板3 μL(15 ng);總體積50 μL。

PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min;56 ℃復性1 min;72 ℃延伸1 min;共30個循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物在1%(wt/vol)的瓊脂糖凝膠中電泳,電泳結(jié)束后,將凝膠浸泡于TAE緩沖液(含20 μg/mL的EB)中10 min,隨后在216 nm紫外燈下呈現(xiàn)橙色條帶。將目的條帶割下,并選用DNA純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收。使用分光光度計對已純化的PCR擴增產(chǎn)物進行定量。使用羅氏測序系統(tǒng)對DNA進行測序。

1.2.3測序結(jié)果分類鑒定將焦磷酸測序后所得序列,根據(jù)barcode分配到對應(yīng)的樣品中,并去除barcode和引物序列,去掉含有“N”的序列,同時對序列長度進行篩選,僅保留長度大于400 bp的序列,得到有效的序列文件。使用mothur v1.25.1[7]的classify.seqs命令,采用Silva的核糖體小亞基(SSU)rRNA序列數(shù)據(jù)庫V102的分類信息,得到序列的分類信息。

1.2.4多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析使用mothur v1.25.1[7]對老面樣品中細菌的多樣性指數(shù)進行分析,以0.03為cutoff值劃分可操作分類單元(Operational taxonomic unit,OTU),計算樣品的多樣性指數(shù)(Chao1和ACE值),并繪制稀釋(rarefaction)曲線。細菌的16S rDNA在樣品中的覆蓋度(Coverage),根據(jù)序列中的Singleton(只有一條序列的OTU),用公式C=[1-(n1/N)]×100來計算。其中,n1代表singleton的數(shù)量,N則表示總序列數(shù)。確定用于構(gòu)建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹的OTU數(shù)目,并從中各選取一條代表性序列,將其與NCBI的GenBank中的序列進行Blast比對,隨后將結(jié)果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83[8]進行比對,再將比對的結(jié)果用Mega v4.0[9]中的Neighbour-joining[10]方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與討論

2.1序列信息和多樣性指數(shù)

對焦磷酸高通量測序的結(jié)果進行分析,根據(jù)添加的barcode將序列分類到三個樣品中,去掉含有“N”的序列及其他低質(zhì)量的序列,保留長度在400 bp以上的序列,去除序列里的嵌合體(Removing chimeras),最終,LM17,LM5,以及LM2三個樣品分別得到552,595和2010條細菌序列用于后續(xù)分析(表1)。樣品LM5中,OTU數(shù)目和細菌群落的多樣性均高于LM17和LM2。樣品中細菌的稀釋曲線如圖1所示,在cutoff為0.03時,曲線未達到平臺期,呈現(xiàn)上升的趨勢,但是,樣品LM17和LM2的覆蓋度仍達到了90%以上,可見基于本實驗的測序深度盡管會忽略樣品中某些含量較少的微生物群落(rare biosphere),但在老面制作過程中發(fā)揮主要作用的微生物均已得到分析。老面制作過程中的主要微生物為乳酸菌[11-12],在樣品LM17和LM2中,在科和屬的分類水平上,乳酸菌都是其中的優(yōu)勢微生物,而樣品LM5可能在其制作過程中因環(huán)境因素等的影響,受到了葡萄球菌的污染,乳酸菌成為其中的第二優(yōu)勢微生物(圖3)。

表1　基于16S rDNA序列相似度為97%的細菌豐度Table 1　Bacterial richness based on the 16S rDNA sequence similarity of 97%

圖1　基于16S rDNA序列相似度為97%的 rarefaction方法估計老面樣品中細菌多樣性Fig.1　Estimated sourdough bacterial community diversity, according to the rarefaction method,depending on the 16S rDNA sequence similarity of 97%

利用韋恩圖(Venn diagram)進一步研究三個老面樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)關(guān)系(圖2)。結(jié)果顯示,三個老面樣品中共有的OTU類型數(shù)量為1,占總序列數(shù)的9%,對該OTU進行分類分析可知,屬于舊金山乳桿菌(Lactobacillussanfranciscensis)。除此之外,樣品LM17和樣品LM2中還含有松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)。雖然三個老面樣品均包含其特有的OTU類型,但它們在總序列數(shù)中所占的比例均較低。

圖2　三個老面樣品中共有OTU分析圖Fig.2　Venn diagram showing the shared OTUs in the three traditional sourdoughs

2.2細菌群落多樣性

圖3　三個老面中細菌在不同分類水平的分布Fig.3　The major families and genera in fermented sourdough

根據(jù)Silva的SSU rRNA序列數(shù)據(jù)庫對獲得的序列進行分類,三個老面樣品中的細菌群落結(jié)構(gòu)的組成存在著差異,尤其是LM5樣品與其余兩個樣品在科與屬的分類水平上差異顯著。圖3展示的是三個老面樣品在科和屬水平上的分布情況。在LM17樣品中,共檢測到了3個細菌門的序列,其中有10%的序列屬于藍藻門(Cyanobacteria),經(jīng)分析,這些序列是屬于葉綠體的,葉綠體的出現(xiàn)可能是由老面店鋪堆放的蔬菜引起的,這也從一個側(cè)面反映出老面制作環(huán)境影響著其中微生物菌群的組成。為了排除干擾,刪除屬于葉綠體的序列后,占總序列99%的序列屬于厚壁菌門(Firmicutes)。Ercolini等[11]采用基于16S rDNA的焦磷酸高通量測序技術(shù)分析老面樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu),厚壁菌門也同樣是其中主要的優(yōu)勢門。在厚壁菌門中,序列可以分為7個科,其中屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae)的序列占總序列的89%,其他屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae),葡萄球菌科(Staphylococcaceae),肉桿菌科(Carnobacteriaceae)等的序列,占總序列的比例均不足1%。在屬這一分類水平上,總序列中64%的序列都屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),乳桿菌屬作為乳酸菌中最大的一個屬,其在人和動物胃腸道微生態(tài)平衡中起著重要的作用,也是乳制品發(fā)酵劑以及益生菌產(chǎn)品的主要菌株,Zhang等[12]通過對5個老面中的微生物群落結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)進化分析,同樣得出乳桿菌屬是老面中主要的優(yōu)勢屬。

圖4　細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.4　Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences and their phylogenetic relationships

LM5樣品中的細菌組成比較復雜,雖然僅檢測到了4個門,序列所占比例較高的是厚壁菌門(94%)和變形菌門(Proteobacteria)(5%),但是在科和屬的水平上,LM5樣品明顯不同于其他兩個樣品,分別檢測到了13個科和25個屬。在科的分類水平上,優(yōu)勢科是葡萄球菌科(Staphylococcaceae)(43%),其次是乳桿菌科(20%)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)(12%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(3%)等。在屬的分類水平上,葡萄球菌屬(Staphylococcus)(41%)是最主要的優(yōu)勢屬,此外,占總序列的6%,4%,3%和2%的序列分別屬于副乳桿菌屬(Paralactobacillus)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、德庫菌屬(Desemzia)、庫爾特氏桿菌屬(Kurthia)。老面中主要的細菌是乳酸菌,乳酸菌能夠形成細菌素和類細菌素等抑菌類物質(zhì),可以延長發(fā)酵面食的貨架期,同時也能夠產(chǎn)生胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)等增強免疫功能的物質(zhì)[2,13-14]。然而在該樣品中,屬于乳酸菌的序列較少,因此可能存在一定的安全隱患,需要進一步研究證實。

在LM2樣品中,共檢測到5個門,優(yōu)勢門也是厚壁菌門,其序列所占比例高達99%。在科的水平上,乳桿菌科是主要的優(yōu)勢科,共有99%的序列屬于乳桿菌科。在檢測到的6個屬中,豐度較高的為乳桿菌屬(87%)。

通過比較上述分析結(jié)果,三個老面樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)存在著一定的差異性,尤其是LM5樣品,其優(yōu)勢菌群與另外兩個樣品存在著一定的差異。在LM17樣品和LM2樣品中豐度最高的屬是乳桿菌屬,它是LM5樣品中的第二優(yōu)勢菌屬,其比例僅有14%。LM5樣品中豐度最高的葡萄球菌屬未能在LM2中檢測到,并且其在LM17樣品中的比例也不足1%。除此之外,在LM5樣品中豐度比較高的幾個屬,在LM17樣品和LM2樣品中的比例均較低甚至為零。不同老面樣品中菌群出現(xiàn)差異的原因很多,主要是老面的制作環(huán)境比較開放,其次,原料品質(zhì)、制作工藝、加工設(shè)備、制作環(huán)境等不同程度地影響著老面中的微生物多樣性。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

分別選自三個樣品中序列數(shù)大于2%的OTU來構(gòu)建細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4所示。在LM17樣品中,豐度最高的兩個OTU分別是LM17_2(22%)和LM17_1(17%),它們均與舊金山乳桿菌(L.sanfranciscensisstrainPON100118)(KM822615)和(L.sanfranciscensisstrain PON100419)(KM822616)呈現(xiàn)出較高的相似度,舊金山乳桿菌是制作發(fā)酵面團的主要菌種之一,屬于專性異型發(fā)酵乳酸菌,具有蛋白酶、二肽酶和氨肽酶等的活性,同時在面團發(fā)酵過程中也能利用麥芽糖釋放出葡萄糖,供一些不具備麥芽糖代謝功能的微生物(如假絲酵母,Candida humil)利用[15-17]。Minervini等[18]采用富集純分離培養(yǎng)與鑒定的方法得出類似的結(jié)果,分離自19個老面樣品的乳酸菌中,舊金山乳桿菌(占總?cè)樗峋壤?8%)是最主要的優(yōu)勢菌,其次是植物乳桿菌(占總?cè)樗峋壤?6%)。

在樣品LM5中,豐度最高的OTU LM5_3(13%),以及豐度較低的OTU LM5_1和OTU LM5_6,均與馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorumstrain bbm6)(KP224447)呈現(xiàn)出較高的相似度。有24條序列屬于OTU LM5_5,占總序列的4%,以及豐度最低的OTU LM5_4,二者與松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuristrain 2218)(KR067567)和小牛葡萄球菌(Staphylococcusvitulinusstrain BCL-2)(KM378591)均顯示出較高的相似度。Landeta等[19]對分離自臘肉中的微生物進行鑒定,其中馬胃葡萄球菌是主要的優(yōu)勢菌,此外,葡萄球菌屬能夠釋放脂酶并具有硝酸還原酶的活性,這在臘肉的風味和顏色方面發(fā)揮著重要的作用。

在樣品LM2中,豐度最高的兩個OTU LM2_1(54%)和LM2_5(12%),以及樣品LM5中豐度第二高的OTU LM5_2(8%),也與上述兩株菌呈現(xiàn)出較高的相似度。樣品LM2中豐度相對較低的OTU LM2_3(3%),與乳桿菌(L.rossiaestrain PON100503)(KM822614)、植物乳桿菌(L.plantarumstrain THK-aB116)(JX566989)和(L.plantarumstrain Lu7)(KC478507)都顯示出較高的相似度。植物乳桿菌是人體胃腸道的益生菌群,代謝過程中能夠產(chǎn)生包括細菌素在內(nèi)的多種天然抑菌物質(zhì),具有促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及提高機體免疫力等多種功能。包含60條(3%)序列的OTU LM2_4,與面包乳桿菌(L.crustorumstrain M30I-9)(KJ361846)顯示出較高的相似度。面包乳桿菌是一種新型益生菌,Sharafi等[20]從傳統(tǒng)乳制品中也分離到了面包乳桿菌,其具有耐膽汁、耐酸、耐鹽等特性,并且對腸道病原菌具有較強的抗菌活性。

3　結(jié)論

香格里拉縣位于偏遠的云南省迪慶自治州,當?shù)匕l(fā)酵面食多選用自然發(fā)酵的老面作為發(fā)酵劑,老面樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)除受氣候因素的影響外,主要受自身制作環(huán)境的影響,因此采集自該地區(qū)的三個老面樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)存在著一定的差異性。本研究中,樣品LM5的多樣性明顯高于其他兩個樣品,其中的細菌結(jié)構(gòu)及組成都比較復雜,同時還檢出了較高比例的葡萄球菌屬,葡萄球菌屬中包含40個以上的菌種,其中一部分屬于潛在的致病菌,除此之外,也不能排除葡萄球菌屬外的其他潛在致病菌的存在,因此暗示了一些發(fā)酵面食可能存在著潛在的食品安全隱患。不同的是，有研究表明，在老面中檢測到了一些其他條件致病菌，如糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、藤黃微球菌(M.luteus)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)等[3,21-22〗[11-12]。

老面中,乳酸菌是重要的微生物組成部分,在樣品LM17和LM2中,乳酸菌是主要的優(yōu)勢菌,乳酸菌能通過產(chǎn)生有機酸使原料快速酸化,此外,其產(chǎn)生的胞外多糖、細胞素、芳香物質(zhì)等,也間接影響發(fā)酵面食的口感、質(zhì)地、老化等品質(zhì),同時還有利于抑制發(fā)酵面食的微生物腐敗。和單純酵母發(fā)酵劑相比,老面制作的發(fā)酵面食口感和風味獨特,可是后者更易出現(xiàn)食品安全隱患,因此,在以后的研究中,需要我們從老面樣品中挖掘有益的微生物資源,摒棄其中的致病菌,調(diào)制出具有優(yōu)良菌種組成(含乳酸菌)的發(fā)酵劑,從而制作出風味、品質(zhì)俱佳的發(fā)酵面食。

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Pyrosequencing analysis of sourdough bacterial community diversity

ZHANG Hai-yan,LIU Chen-jian+,LIU Xiang-xiang,LUO Yi-yong,LI Xiao-ran*

(Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Sourdough has various microbial compositions, which brings various microbial fermentation products and flavors. Therefore,analysis of sourdough bacterial community diversity can provide useful information for developing better food fermentation agent. Three samples were collected from Shangri-La of Yunnan Province. After barcoded pyrosequencing,the microbial community diversity of the samples were analyzed. The three samples all had high bacterial diversity. In the 17-year-old and 2-year-old sourdough,the predominant bacteria wereLactobacillussanfranciscensis. The 2-year-old sourdough had small number of sequences belonging toL.rossiaeandL.plantarum. In 5-year-old sourdough,the predominant bacteria wasStaphylococcusequorum,followed byLactobacillussanfranciscensis. Conclusion:The samples of sourdough had higher bacterial community diversity dominated by lactic acid bacteria,andLactobacillusbringsa wealth of nutrients and flavor for fermentation pasta.Staphylococcusdetected of higher abundance implied potential risk in food safety.

Sourdough;bacterial community;pyrosequencing;diversity

2016-01-12+并列第一作者

張海燕(1987-),女,碩士生,研究方向:微生物分子生態(tài)學,E-mail:kgonghaiyan@163.com。

柳陳堅(1968-),男,博士,教授,研究方向:應(yīng)用微生物,食品營養(yǎng)與安全,E-mail:newstaar8@hotmail.com。

李曉然(1984-),女,博士,副教授,研究方向:微生物分子生態(tài)學,E-mail:starkeyran@163.com。

國家自然科學基金項目(31260397)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0145-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.020