王　福,閆珂巍,梅國榮,盧俊宇,潘歡歡,陳鴻平,陳　林,何玉瓊,劉友平

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137)

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DNA條形碼序列對(duì)藥食兩用品花椒的品種鑒定

王福,閆珂巍,梅國榮,盧俊宇,潘歡歡,陳鴻平,陳林,何玉瓊,劉友平*

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137)

目的:利用DNA條形碼鑒定技術(shù),快速、準(zhǔn)確的鑒別中藥花椒,區(qū)別中藥花椒及其市售香料花椒的品種來源差異。方法:采用植物DNA試劑盒提取花椒及其混偽品基因組DNA,對(duì)全部收集樣品的ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,計(jì)算物種種間種內(nèi)Kimura2-parameter(K2P)遺傳距離。采用Blast、最近距離法及基于ITS2序列構(gòu)建Neighbor-joining(NJ)系統(tǒng)聚類樹進(jìn)行鑒別分析。結(jié)果:中藥花椒及香料花椒的序列長度為224～227 bp,中藥花椒種間平均K2P遺傳距離明顯大于香料花椒種內(nèi)平均K2P遺傳距離;ITS2分子系統(tǒng)樹顯示,中藥花椒及香料花椒均聚為一單系分枝。結(jié)論:ITS2序列作為DNA條形碼能準(zhǔn)確鑒別中藥花椒及其香料花椒,為中藥花椒及其香料花椒的鑒別提供了依據(jù)。

中藥花椒,ITS2,psbA-trnH,分子鑒定,DNA條形碼

中藥花椒為蕓香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)或花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)的干燥成熟果皮[1],具有溫中止痛,殺蟲止癢之功效。中藥花椒的兩基源植物花椒與青椒即可以藥用,也被廣泛用作調(diào)味品食用。市售香料青花椒植物名為竹葉花椒(Z.armatum),被地方標(biāo)準(zhǔn)收載作為藥用(廣西)[2],其商品名也叫青椒?；ń吩谑袌?chǎng)上流通最廣,其次為竹葉花椒,青椒(Z.schinifolium)則主要以野生狀態(tài)分布,資源稀少。市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),竹葉花椒商品名與中藥花椒基源種青椒異物同名,易被誤用為花椒藥材;另外,野花椒(Z.simulans)與簕欓花椒(Z.avicennae)隨著花椒市場(chǎng)價(jià)格的高低波動(dòng),在市場(chǎng)中常常作為香料流通,商品名統(tǒng)為小椒,常被作為花椒藥材的混偽品?；ń匪幉呐c香料花椒品種來源較為復(fù)雜,且隨著年份的變化而變化,因此分辨可藥用及可食用香料花椒品種,對(duì)中藥花椒的臨床安全以及香料花椒市場(chǎng)的規(guī)范具有重要作用。

近年來,在中藥鑒定方面,陳士林[3]等通過大尺度取樣和大量的DNA條形碼序列篩選,首次提出以ITS2序列為核心序列,psbA-trnH為補(bǔ)充的藥用植物DNA條形碼鑒定體系,姚輝[4]等提出ITS2序列可作為植物物種鑒定的通用條形碼。ITS2序列的鑒別能力已在多種藥用植物和藥材的鑒定中得到了驗(yàn)證和應(yīng)用[5-9]。在中藥花椒鑒定方面,沈潔等[10]采用克隆測(cè)序ITS序列的方式對(duì)7個(gè)不同居群的花椒和野花椒、竹葉花椒進(jìn)行了鑒定,但缺少對(duì)青椒及簕欓花椒的研究;候典云等[11]應(yīng)用ITS/ITS2序列對(duì)中藥花椒藥材進(jìn)行了鑒定,而缺乏對(duì)市售香料花椒的鑒定。中藥花椒及其香料花椒在市場(chǎng)上主要以干燥成熟果皮流通,因此對(duì)花椒干燥品的DNA條形碼鑒定對(duì)中藥花椒及香料花椒的快速鑒別具有重要意義。同時(shí)由于ITS序列在部分種屬中序列獲得率偏低[12-13],故本研究主要選用核基因ITS2片段,通過對(duì)中藥花椒及其香料花椒31份個(gè)體進(jìn)行基因片段擴(kuò)增、測(cè)序、并應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行分析,以期為中藥花椒及其香料花椒干燥品的準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)。

表1　實(shí)驗(yàn)所用樣本信息

注:“-”代表沒有樣品采集信息。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)采集樣品信息見表1,含花椒屬植物31個(gè),中藥花椒有16份,其中花椒(Z.bungeanum)13份,青椒(Z.schinifolium)3份;香料花椒竹葉花椒(Z.armatum)11份;其他品種4份,野花椒(Z.simulans)3份,簕欓花椒(Z.avicennae)1份。GenBank下載序列9條,含青椒(Z.schinifolium)6條,野花椒(Z.simulans)2條,簕欓花椒(Z.avicennae)1條。實(shí)驗(yàn)所用樣品均為干燥成熟果皮,由成都中醫(yī)藥大學(xué)陳新教授鑒定,憑證標(biāo)本于常溫保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館。

植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China);2×Taq PCR MasterMix(Tiangen Biotech Co.,China);引物由上海生工(SangonCo.,China)合成。

Retsch MM400球磨儀德國萊馳公司;PTC200PCR儀美國BIO-Rad公司;GelDox XR凝膠成像系統(tǒng)美國BIO-Rad公司;DYY-8C電泳儀北京六一儀器廠;BI3730XL測(cè)序儀美國Applied Bio-systems 公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品DNA 的提取、擴(kuò)增和測(cè)序用改良DNA提取試劑盒提取樣品DNA,水浴時(shí)間改為2 h、DNA沉淀劑為-20 ℃冷凍異丙醇[11],其它步驟均按試劑盒提取方法;ITS2序列擴(kuò)增使用DNA條形碼通用引物。全部樣品ITS2序列的PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序參考陳士林[14]等研究。

1.2.2數(shù)據(jù)處理測(cè)序所得的峰圖采用CodonCodeAligner V5.0軟件(CodonCode Co.,USA)對(duì)序列峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接,去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列,利用軟件MEGA6計(jì)算物種種內(nèi)種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離,構(gòu)建鄰接(Neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹,利用Bootstrap(BS)(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

2　結(jié)果與分析

2.1中藥花椒及香料花椒種內(nèi)、種間變異分析

花椒種內(nèi)不同來源樣品的ITS2序列長度為224 bp,分為3個(gè)單倍型(表1),單倍型B1有3條序列全部與HM851462相同,單倍型B2有5條序列全部與HG002512相同,單倍型B3有5條序列與DQ016542相同,花椒種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)為7;青椒種內(nèi)不同來源的ITS2序列長度為224 bp,序列種內(nèi)無變異,同為單倍型C1?；ń贩N內(nèi)最大遺傳距離為0.029,種內(nèi)平均遺傳距離為0.004;青椒種內(nèi)遺傳距離為0;竹葉花椒種內(nèi)不同來源的ITS2序列長度為227 bp,單倍型有二種,單倍型A1與JX393932相同,單倍型A2與DQ016546相同;野花椒種內(nèi)不同來源的ITS2序列長度為224 bp,二種單倍型;簕欓花椒種內(nèi)不同來源的ITS2序列長度為224 bp,同為二種單倍型。中藥花椒及其香料花椒ITS2序列信息見表2。

花椒ITS2序列種間最小K2P為0.024,青椒ITS2序列種間最小K2P為0.016,均遠(yuǎn)大于花椒種內(nèi)最大K2P距離0.019及青椒種內(nèi)最大的K2P距離0。香料花椒竹葉花椒、野花椒及簕欓花椒的種內(nèi)最大K2P距離均小于各物種種間最小K2P距離,中藥花椒及其香料花椒ITS2序列K2P遺傳距離見表3。

表2　中藥花椒及其香料花椒ITS2序列信息表

表3　中藥花椒及其香料花椒ITS2序列K2P遺傳距離

2.2中藥花椒及香料花椒的鑒別

基于最小距離法鑒定結(jié)果表明,單一ITS2序列對(duì)花椒、青椒、簕欓花椒和竹葉花椒的物種鑒定率為100%。但對(duì)同屬野花椒樣品(DQ016545)不能成功鑒定,鑒定成功率為93.0%;同時(shí)利用“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”以及BLAST搜索鑒定均證實(shí)該野花椒樣品不能成功鑒定。基于ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹見圖1,結(jié)果表明,花椒、青椒、竹葉花椒、簕欓花椒與野花椒各自聚為一支,可以明顯區(qū)分,其中花椒與野花椒、竹葉花椒的親緣關(guān)系較為密切,花椒藥材的兩個(gè)基源物種花椒和青椒的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn),簕欓花椒與青椒親緣關(guān)系較近。

圖1　基于ITS2序列構(gòu)建的中藥花椒及其香料花椒的NJ樹Fig.1　The NJ tree of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers

3　結(jié)論與討論

針對(duì)本實(shí)驗(yàn)花椒屬5個(gè)物種的ITS2序列可以鑒別所有花椒屬植物,但采集于山東沂蒙山野花椒樣品除外。同時(shí)基于ITS2序列的BLAST搜索、K2P遺傳距離證實(shí)采集于山東沂蒙山野花椒ITS2序列不能準(zhǔn)確鑒別到種,誤鑒定為花椒(GQ434824),而采集于廣東乳源的野花椒(HM851466)ITS2序列可以準(zhǔn)確鑒別到種。因此,在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[15-16],對(duì)所有野花椒樣品的psbA-trnH序列進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序,結(jié)果證實(shí)psbA-trnH可成功鑒別該野花椒樣品。即ITS2與psbA-trnH混合序列可以成功鑒別實(shí)驗(yàn)所用中藥花椒及其香料花椒樣品,研究結(jié)果與陳士林[17]提出以ITS2序列為核心序列,psbA-trnH為補(bǔ)充的藥用植物DNA條形碼鑒定體系相一致。

花椒及其混偽品樣品K2P遺傳距離分析與NJ系統(tǒng)聚類樹結(jié)果顯示,花椒與野花椒、竹葉花椒的親緣關(guān)系較為密切,花椒藥材的兩個(gè)基源物種花椒和青椒的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn),簕欓花椒與青椒親緣關(guān)系較近。青椒、花椒及其竹葉花椒皆為藥食兩用品,而市場(chǎng)上的野花椒及其簕欓花椒則常作為香料或中藥花椒的混偽品流通,其科學(xué)性有待考證。李惠勇[18]對(duì)藥典收載花椒藥材品種花椒和青椒進(jìn)行了本草學(xué)記載、以及生藥學(xué)、化學(xué)成分、藥效學(xué)等幾方面的研究,結(jié)果顯示均存在較大差異,故建議將花椒藥材兩基源物種花椒和青椒分開使用。

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Authentication of homology of medicine and food Huajiao by DNA barcoding sequences

WANG Fu,YAN Ke-wei,Mei GUO-rong,LU Jun-yu,PAN Huan-huan,CHEN Hong-ping,CHEN Lin,HE Yu-qiong,LIU You-ping*

(College of pharmacy,Cheng Du University of TCM,ChengDu 611137,China)

Objective:To authenticate Pericarpium Zanthoxyli and investigate the origin of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers accurately,DNA barcoding technique was used. Methods:Total genomic DNA was isolated from Pericarpium Zanthoxyli and its adulterants using the plant DNA kit. The ITS2 sequences of all samples were amplified and sequenced. The Kimura 2-parameter(K2P)distances were calculated. Identification analyses were performed using Blast,nearest distance and Neighbor-joining(NJ)methods. Results:The lengths of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers were between 224～227 bp. Interspecific distances of Pericarpium Zanthoxyli was bigger than the intraspecific distances of commercial spice peppers. The NJ tree showed that every breeds had a single branches. Conclusion:The sequence of ITS2 was efficient barcode for the authentication of Pericarpium Zanthoxyli and other spices,and provided according for the identification of Pericarpium Zanthoxyli and commercial spice peppers.

Pericarpium Zanthoxyli;ITS2;psbA-trnH;molecular identification;DNA barcode

2015-03-23

王福(1988-)，碩士，從事中藥化學(xué)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究， E-mail:wangfunny00@163.com。

劉友平(1964-)，研究員，博士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究， E-mail:lyp11cdutcm.edu.cn。

2015版《中國藥典》增修訂項(xiàng)目。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000