田康明,爾　昊,路福平,王正祥

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物重點實驗室,天津 300457)

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磷酸鹽精確控制策略提升大腸桿菌生長和產(chǎn)物合成效率

田康明,爾昊,路福平*,王正祥

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物重點實驗室,天津 300457)

磷酸鹽是微生物生長代謝關(guān)鍵物質(zhì)之一,研究發(fā)酵進(jìn)程中的磷酸鹽變化與變化規(guī)律及其與特定目標(biāo)產(chǎn)物合成效率間相互關(guān)系,有助于提升微生物的生長和產(chǎn)物合成效率,建立新的發(fā)酵控制模式。本文以工業(yè)上重要的大腸桿菌為研究對象,研究了發(fā)酵過程中磷酸鹽含量變化規(guī)律,解析了大腸桿菌生長和產(chǎn)酶過程與磷酸鹽消耗間的關(guān)系,并通過調(diào)控磷酸鹽濃度提高產(chǎn)酶水平。通過搖瓶發(fā)酵實驗,確定了大腸桿菌的磷酸鹽耐受上限為磷酸氫二銨 24.0 g/L、磷酸二氫鉀81.0 g/L,磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀最適初始含量分別為1.0 g/L、10.12 g/L,補(bǔ)加方式為:發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加總量的一半,剩余部分發(fā)酵4 h后補(bǔ)加。在此基礎(chǔ)上,大腸桿菌細(xì)胞密度和賴氨酸脫羧酶的比酶活分別提高了58.42%和14.09%。研究結(jié)果證實通過動態(tài)監(jiān)控并精確控制發(fā)酵過程中磷酸鹽的存在量可以有效的提升大腸桿菌的生長代謝和產(chǎn)物合成效率。

大腸桿菌,磷酸鹽,發(fā)酵,控制策略

磷是微生物代謝所需的主要元素之一,尤其對于微生物生長繁殖具有重要作用[1]。無機(jī)磷可借助微生物分解有機(jī)物時所產(chǎn)生的有機(jī)酸和CO2轉(zhuǎn)化成可溶性磷酸鹽,被微生物吸收,成為有機(jī)磷[2]。有機(jī)磷在有氧條件下可以被微生物分解,從而形成磷酸鹽[3-4]。磷還是磷壁酸、高能磷酸化合物的重要組成部分[5-8],革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁含有大量磷壁酸,ATP作為高能磷酸化合物的典型代表[9-11],實質(zhì)是傳遞能量,使熱力學(xué)上不利的反應(yīng)能順利進(jìn)行[12-13]。磷在微生物生長代謝的EMP途徑[14]和HMP途徑[15]中發(fā)揮重要作用?？梢?微生物生長過程中磷酸鹽的變化情況是監(jiān)控細(xì)胞代謝過程的重要指標(biāo)。

長期以來,發(fā)酵過程控制參數(shù)局限于培養(yǎng)溫度、pH、溶氧水平、底物濃度等。對于磷代謝在發(fā)酵控制方面的價值,雖已有較多研究,但控制策略停留在發(fā)酵培養(yǎng)基組成階段。如:謝濤[16]研究了磷酸鹽限量對胞內(nèi)磷積累的影響。隨著酵母在富磷培養(yǎng)基、低磷培養(yǎng)基培養(yǎng)時,胞內(nèi)磷積累也隨之變化。這只是說明限制培養(yǎng)基中的磷濃度是發(fā)酵過程中的必要條件。同樣,鐘國華[17]、吳學(xué)超[18]、王普[19]在優(yōu)化微生物發(fā)酵過程的研究中,也只是簡單從宏觀上優(yōu)化了磷酸鹽的添加量,而非精確監(jiān)控磷酸鹽的變化過程來實現(xiàn)研究目的。

本研究通過對發(fā)酵過程中磷酸鹽含量的定量檢測,系統(tǒng)研究大腸桿菌細(xì)胞生長和產(chǎn)酶過程中磷酸鹽的變化及其規(guī)律,并通過合理調(diào)整磷酸鹽的添加方式提升大腸桿菌的生長效率和產(chǎn)酶水平,揭示了磷酸鹽控制在發(fā)酵過程優(yōu)化與控制中的巨大潛在應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)42-0#,保藏于天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院酶與應(yīng)用微生物研究室。該菌種為本研究室前期構(gòu)建,具有合成賴氨酸脫羧酶的能力,是工業(yè)上用于高效轉(zhuǎn)化賴氨酸為戊二胺的重組菌。

1.1.2試劑氨芐青霉素,MES和磷酸吡哆醛購自Sigma公司;茚三酮上海生工生物工程有限公司;L-賴氨酸,β-巰基乙醇和SDSSolarbio公司;過硫酸銨Invitrogen公司;其他試劑均為分析純化學(xué)試劑。

1.1.3儀器3-18k冷凍離心機(jī)Sigma公司;DYY-III-6B電泳儀北京市六一儀器廠;PBl502-S電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)公司;AB204-S分析天平梅特勒-托利多儀器(上海)公司;EHWY-2102恒溫?fù)u床上海智誠有限公司;HS-1300-V型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SX500全自動高壓滅菌鍋日本TOMY公司;JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.1.4培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10,瓊脂20,pH7.0。氨芐青霉素50 μg/mL。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10,pH7.0。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):磷酸氫二銨2,磷酸二氫鉀6.75,檸檬酸0.85,硫酸銨3,50%甘油20 mL,140 g/L硫酸鎂母液5 mL,微量元素1 mL,pH7.0。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):磷酸氫二銨1,磷酸二氫鉀10.12,檸檬酸0.85,硫酸銨3,50%甘油20 mL,140 g/L硫酸鎂母液5 mL,微量元素1 mL,pH7.0。

微量元素(g/L):FeSO4·7H2O 50,無水CaCl27.56,ZnSO4·7H2O 11.0,MnSO4·4H2O 1.96,CuSO4·5H2O 5.0,(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.5,Na2B4O7·10H2O 0.1。

1.2實驗方法

1.2.1大腸桿菌的磷酸鹽耐受上限實驗在250 mL三角瓶(50 mL裝液量)中考察大腸桿菌的磷酸鹽耐受上限。在原始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀的添加濃度分別為2,6.75、3,10.12、4,13.50、5,16.88、16,54.00、18,60.75、20,67.8、22,74.25、24,81.00 g/L,其余物質(zhì)種類和含量不變,調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH至7.0。發(fā)酵24 h后大腸桿菌細(xì)胞密度低于正常值的25%,這時的磷酸鹽濃度為大腸桿菌的磷酸鹽耐受上限[21]。

1.2.2大腸桿菌細(xì)胞生長及發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗分析采用單因素實驗,分別考察磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀的初始含量對大腸桿菌細(xì)胞生長的影響。磷酸氫二銨初始含量分別選取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L,磷酸氫二銨初始含量分別選取1.69、3.38、6.75、10.12、13.50 g/L,其余物質(zhì)種類和含量不變,調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH至7.0。并分析其發(fā)酵過程中磷酸鹽的消耗情況。

1.2.3分批補(bǔ)加磷酸鹽對大腸桿菌細(xì)胞生長的影響采用單因素實驗,分別考察補(bǔ)加時間和補(bǔ)加量對大腸桿菌細(xì)胞生長的影響。補(bǔ)加時間分別選取發(fā)酵后2、4、6、8 h;得到最佳補(bǔ)加時間后,補(bǔ)加方式分別選取發(fā)酵初始只添加優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽總量的1/2、1/3、1/4,發(fā)酵到一定時間后補(bǔ)加余下部分的磷酸鹽,并分析其發(fā)酵過程中磷酸鹽的消耗情況。

1.2.4磷酸鹽對大腸桿菌產(chǎn)酶的影響分別以原始發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基在三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵實驗,誘導(dǎo)產(chǎn)酶后,測其蛋白含量、賴氨酸脫羧酶酶活力以及SDS-PAGE的變化情況。

大腸桿菌發(fā)酵液的預(yù)處理:取50 mL發(fā)酵液于離心管中,6000 r/min離心8 min;棄去上清,加入10 mL ddH2O,漩渦震蕩混勻,補(bǔ)加ddH2O至30 mL,6000 r/min離心8 min;棄去上清,加入10 mL PBS,漩渦震蕩混勻,補(bǔ)加PBS至30 mL,6000 r/min離心8 min;重復(fù)1次;加入10 mL PBS重懸菌體,超聲破碎。(超聲破碎條件:超聲3 s,間隙2 s,溫度25 ℃,破碎時間30 min,功率40%)。

1.2.5磷酸鹽含量的測定采用磷酸鹽快速檢測試劑盒,來自江蘇銳陽生物科技有限公司。

表1　賴氨酸脫羧酶酶活反應(yīng)體系

1.2.6賴氨酸脫羧酶酶活的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:將1 g/L的L-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成100、200、300、400、500 mg/L,分別取1 mL加入到15 mL具塞刻度試管中,另取一支試管加1 mL水做空白對照;每支試管加入1 mL茚三酮溶液,混勻,加上塞子;沸水浴10 min后放入涼水中冷卻;每支試管加8 mL水補(bǔ)齊10 mL體系;紫外475 nm下檢測吸光度。

賴氨酸脫羧酶酶活測定:測定賴氨酸脫羧酶酶活反應(yīng)體系如表1所示;樣品離心后稀釋適當(dāng)倍數(shù),取1 mL加入到15 mL具塞刻度試管中,另取一支試管加1 mL水做空白對照;每支試管加入1 mL茚三酮溶液,混勻,加上塞子;沸水浴10 min后放入涼水中冷卻;每支試管加8 mL水補(bǔ)齊10 mL體系;紫外475 nm下檢測吸光度。

賴氨酸脫羧酶酶活的定義:37 ℃,pH6.5,反應(yīng)15 min,每消耗100 mg/mL賴氨酸定義為1個酶活單位。

賴氨酸脫羧酶比酶活的定義:細(xì)胞破碎液中1 mg蛋白所對應(yīng)的賴氨酸脫羧酶酶活定義為1個比酶活單位。

1.2.7蛋白濃度的測定按照文獻(xiàn)介紹的方法進(jìn)行[20]。以牛血清白蛋白(V部分)為標(biāo)準(zhǔn)參照。

1.2.8細(xì)胞密度的測定取適量發(fā)酵液經(jīng)過適當(dāng)稀釋,使測定的吸光度值在0.1～0.8范圍內(nèi),再使用紫外分光光度計,于波長600 nm處測定吸光度,所測得結(jié)果即為大腸桿菌的細(xì)胞密度。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用OriginPro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2.1大腸桿菌培養(yǎng)中磷酸鹽添加極限

了解大腸桿菌對磷酸鹽添加極限的要求,對后續(xù)研究磷酸鹽的若干作用以及新工藝路線的形成至關(guān)重要,結(jié)果如圖1所示。發(fā)酵24 h后大腸桿菌發(fā)酵液吸光度A600的正常值為1.383±0.068,而當(dāng)磷酸氫二銨添加量達(dá)到24.00 g/L和磷酸氫二鉀的添加量達(dá)到81.00 g/L時,發(fā)酵24 h發(fā)酵液吸光度A600為0.321±0.015低于正常值的25%,此即為大腸桿菌細(xì)胞對磷酸鹽的耐受上限。

圖1　隨著磷酸氫二銨和磷酸氫二鉀含量的增加對大腸桿菌生長情況的影響Fig.1　Effects of the increasing concentrations of diammonium hydrogen phosphate and potassium hydrogen phosphate on the growth of Escherichia coliW1:(NH4)2HPO4 2 g/L,KH2PO4 6.75 g/L;W2:(NH4)2HPO4 3 g/L,KH2PO4 10.12 g/L;W3:(NH4)2HPO4 4 g/L,KH2PO4 13.50 g/L;W4:(NH4)2HPO4 5 g/L,KH2PO416.88 g/L;W5:(NH4)2HPO4 16 g/L,KH2PO4 54.00 g/L;W6:(NH4)2HPO4 18 g/L,KH2PO4 60.75 g/L;W7:(NH4)2HPO4 20 g/L,KH2PO4 67.8 g/L;W8:(NH4)2HPO4 22 g/L,KH2PO4 74.25 g/L;W9:(NH4)2HPO4 24 g/L,KH2PO4 8100 g/L。

2.2大腸桿菌細(xì)胞生長及發(fā)酵過程磷酸鹽的消耗特征

培養(yǎng)基磷酸氫二銨、基磷酸二氫鉀的初始含量對大腸桿菌細(xì)胞生長的影響分別如圖2、3所示。隨著初始磷酸氫二銨含量的增加,大腸桿菌細(xì)胞密度呈現(xiàn)先上升然后下降接著上升再下降的趨勢。當(dāng)初始磷酸氫二銨含量為1.00 g/L時,最有利于菌體生長,此時大腸桿菌發(fā)酵液吸光度A600為1.143±0.011。隨著初始磷酸二氫鉀含量的增加,大腸桿菌細(xì)胞密度呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢。當(dāng)初始磷酸二氫鉀含量為10.12 g/L時,最有利于菌體生長,此時大腸桿菌發(fā)酵液吸光度A600為1.450±0.002。其發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗情況分別如表2、3所示。當(dāng)初始磷酸氫二銨含量為1.00 g/L時,大腸桿菌單位時間單位體積菌體平均生長速率為(1.893±0.115)×10-3h-1·mL-1,單位時間單位體積磷酸鹽平均消耗速率為7.387±0.241 mg·h-1·mL-1,單位細(xì)胞磷酸鹽比消耗率為8.080±0.053 10-2·g-1細(xì)胞。當(dāng)初始磷酸二氫鉀含量為10.12 g/L時,大腸桿菌單位時間單位體積菌體平均生長速率為(2.507±0.134)×10-3h-1·mL-1,單位時間單位體積磷酸鹽平均消耗速率為12.990±0.138 mg·h-1·mL-1,單位細(xì)胞磷酸鹽比消耗率為11.340±0.162 10-2·g-1細(xì)胞。

表2　磷酸氫二銨的初始含量對大腸桿菌發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗情況的影響

圖2　磷酸氫二銨的初始含量對大腸桿菌細(xì)胞生長情況的影響Fig.2　Effects of initial contents of diammonium hydrogen phosphate on the growth of Escherichia coli cells

圖3　磷酸二氫鉀的初始含量對大腸桿菌細(xì)胞生長情況的影響Fig.3　Effects of the initial contents of monopotassium phosphate on the growth of E. coli cells

磷酸二氫鉀含量(g·L-1)單位時間單位體積菌體平均生長速率(10-3h-1·mL-1)單位時間單位體積磷酸鹽平均消耗速率(mg·h-1·mL-1)單位細(xì)胞磷酸鹽比消耗率(10-2·g-1細(xì)胞)6.751.857±0.0768.463±0.2009.223±0.2901.691.577±0.1143.793±0.1274.990±0.1183.381.537±0.1976.253±0.0787.827±0.14210.122.507±0.13412.990±0.13911.153±0.16213.502.213±0.0869.873±0.2939.280±0.242

2.3分批補(bǔ)加磷酸鹽對大腸桿菌細(xì)胞生長及發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗的影響

磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀的補(bǔ)加時間和補(bǔ)加比例對大腸桿菌細(xì)胞生長的影響分別如圖4、5所示。隨著補(bǔ)加磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀時間的推遲,大腸桿菌細(xì)胞密度與不補(bǔ)加磷酸鹽時相比呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢。在發(fā)酵4 h后補(bǔ)加磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀最有利于菌體生長,發(fā)酵12 h后大腸桿菌發(fā)酵液吸光度A600為2.203±0.016。隨著發(fā)酵4 h后補(bǔ)加磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀含量的增加,大腸桿菌細(xì)胞密度呈現(xiàn)下降的趨勢。發(fā)酵初始只添加優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀含量的1/2,發(fā)酵4 h后補(bǔ)加剩余的1/2磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀最有利于菌體生長,發(fā)酵12 h后大腸桿菌發(fā)酵液吸光度A600為2.191±0.008。2、4、6、8 h發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗情況如圖5所示。其大腸桿菌發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗率分別為57.20%、46.62%、50.06%、38.19%。發(fā)酵4 h后補(bǔ)加1/2、2/3、3/4發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗情況如圖7所示。其大腸桿菌發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗率分別為57.10%、21.43%、43.20%。

圖4　不同時間補(bǔ)加磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀的大腸桿菌細(xì)胞生長情況對比Fig.4　Comparisons of the growth of E. coli cells after the addition of diammonium hydrogen hosphate and potassium dihydrogen phosphate at different times

圖5　發(fā)酵2、4、6、8 h后補(bǔ)加磷酸鹽大腸桿菌發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗情況對比Fig.5　Comparisons of phosphate consumption during the fermentation process of E. coli with the addition of phosphate after 2,4,6 and 8 h

圖6　磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀的不同補(bǔ)加比例對大腸桿菌細(xì)胞生長情況的影響Fig.6　Effects of the ratios of diammonium hydrogen phosphate to potassium dihydrogen phosphate on the growth of E. coli cells

圖7　發(fā)酵4 h后補(bǔ)加1/2、2/3、3/4磷酸鹽的發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗情況對比Fig.7　Comparisons of phosphate consumption during the fermentation process with the addition of 1/2,2/3,3/4 phosphate after 4 h

本研究選擇磷酸氫二銨和磷酸二氫鉀兩種磷酸鹽進(jìn)行研究:首先,磷酸氫二銨具有含氮磷兩種營養(yǎng)成分的特點,在微生物培養(yǎng)基中為菌體提供磷酸根的同時也提供了一定量的氮源;其次,考慮到每摩爾磷磷酸氫二銨和酸二氫鉀均可提供等摩爾的磷酸根離子;最后,這兩種磷酸鹽是微生物培養(yǎng)基中常用的兩種無機(jī)鹽添加物。

2.4磷酸鹽對大腸桿菌產(chǎn)酶水平的影響

原始發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,誘導(dǎo)產(chǎn)酶后,其賴氨酸脫羧酶的酶活力對比結(jié)果如圖8所示。原始發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,賴氨酸脫羧酶的比酶活為78.75 U/mg,優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,賴氨酸脫羧酶的比酶活為89.85 U/mg,增長了14.09%。SDS-PAGE的結(jié)果如圖9所示。從該圖可以看出,在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,蛋白的表達(dá)量均有了顯著提高。

圖8　原始發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶后賴氨酸脫羧酶的比酶活對比Fig.8　Comparisons of the specific enzyme activities of lysine decarboxylase in the original and optimized fermentation media after induction

圖9　原始發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶后SDS-PAGE對比Fig.9　SDS-PAGE analysis of the proteins in the originaland optimized fermentation media after induction M:protein marker;1:空白對照;2:原始發(fā)酵培養(yǎng)基;3:優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。

優(yōu)化培養(yǎng)基中的磷酸鹽含量后,使微生物的生長代謝速率加快,進(jìn)而有利于產(chǎn)物的形成[22]。王建玲等[23]通過響應(yīng)面的方法,雖然對磷酸鹽的含量進(jìn)行了優(yōu)化,使賴氨酸脫羧酶的酶活得到了提高。但只是從宏觀角度進(jìn)行的研究,而本實驗對微生物發(fā)酵過程中的磷酸鹽含量進(jìn)行了精確控制,連續(xù)監(jiān)控微生物生長過程中磷酸鹽的消耗情況,并找到微生物發(fā)酵過程中磷酸鹽最適的補(bǔ)加時間和補(bǔ)加量。

3　結(jié)論

本實驗通過對發(fā)酵過程中磷酸鹽含量變化的檢測,實現(xiàn)大腸桿菌工程菌株的高密度培養(yǎng),進(jìn)而提高賴氨酸脫羧酶酶活和產(chǎn)酶量。對搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化:大腸桿菌的磷酸鹽耐受上限為磷酸氫二銨24.0 g/L、磷酸二氫鉀81.0 g/L。當(dāng)磷酸氫二銨的初始含量為1.0 g/L,磷酸二氫鉀的初始含量為10.12 g/L,磷酸鹽采取補(bǔ)加的方式對大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時,可以實現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng)。通過發(fā)酵過程中磷酸鹽含量的精確控制,使大腸桿菌工程菌株的發(fā)酵液吸光度A600增長了58.42%,在此基礎(chǔ)上,賴氨酸脫羧酶酶活增加了91.20%。基于以上研究結(jié)果,可進(jìn)一步通過監(jiān)控發(fā)酵生產(chǎn)過程中磷酸鹽含量變化趨勢,優(yōu)化工業(yè)發(fā)酵過程,并進(jìn)行更大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn),提高產(chǎn)物合成水平,為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Precise control strategy of phosphate to enhance the cell growth and the efficiency of product synthesis inEscherichiacoli

TIAN Kang-ming,ER Hao,LU Fu-ping*,WANG Zheng-xiang

(College of Biotechnology,Tianjin University of science and technology,Key Laboratory of Industrial Microbiology,Tianjin 300457,China)

Phosphate is one of the key materials for microbial growth and product synthesis. Thus,systematic studies of the changes of phosphate,its change rule and the corresponding relationships between the change rule and the synthetic efficiency of target products help to improve the growth of microorganisms and the efficiency of product synthesis. This will also establish a novel control mode of fermentation processes. In this paper,industrially importantEscherichiacoliwas used as a research object to investigate the change rule of phosphate in the fermentation process as well as analyze the corresponding relationships between the growth ofEscherichiacoli,enzyme production and phosphate consumption. Subsequently,the production level of lysine decarboxylase was increased by controlling the concentrations of phosphate. Through shake flask fermentation,the highest concentrations of diammonium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate thatEscherichiacolicells could tolerate were determined to be 24.00 g/L and 81.00 g/L,respectively. The optimum initial contents of diammonium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate were 1.00 g/L and 10.12 g/L,respectively. Besides,only 1/2 of the total amounts of diammonium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate was added at the beginning,while the remaining 1/2 was complemented after 4 hours of fermentation. After cultivated under the optimized conditions,the cell density of recombinantEscherichiacoliand the specific activity of lysine decarboxylase were increased by 58.42% and 14.09%,respectively. According to the result,the cell growth and products synthesis of E. coli can be improved by dynamic determination and precise control of the phosphate concentration during the fermentation process.

Escherichiacoli;phosphate;fermentation;control strategy

2015-04-27

田康明(1985-),男,博士,助理研究員,研究方向:工業(yè)微生物育種,E-mail:kangmingtian@tust.edu.cn。

路福平(1967-),男,博士,教授,研究方向:酶工程,E-mail:lfp@tust.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(21446010)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000