丁艷平,孟　媛,張晉平,邵寶平

(1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州　730070；2.蘭州大學生命科學學院，甘肅蘭州　730000)

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OrexinA在牦牛和黃牛消化道中的表達差異

丁艷平1,孟媛1,張晉平1,邵寶平2

(1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070；2.蘭州大學生命科學學院，甘肅蘭州730000)

通過分析促食欲素A(OrexinA)在牦牛和黃牛消化道不同部位的分布特征及表達差異，探討OrexinA對牦牛能量代謝的調(diào)節(jié)作用.運用免疫組織化學SP法檢測OrexinA在牦牛和黃牛胃腸道的表達，利用Image-ProPlus6.0軟件對其表達強度進行半定量分析.結(jié)果表明，OrexinA在牦牛和黃牛的皺胃、幽門、賁門和十二指腸均有表達，但表達特征不同；牦牛胃和十二指腸中OrexinA陽性反應產(chǎn)物極顯著地低于黃牛(P<0.01)；牦牛胃腸道中OrexinA陽性反應產(chǎn)物的吸光度分布為：皺胃區(qū)>幽門區(qū)>賁門區(qū)>十二指腸區(qū)(P<0.01).推測牦牛通過胃腸道OrexinA的低表達，調(diào)節(jié)中樞及外周組織的激素水平，從而維持機體能量代謝水平，適應青藏高原的特殊環(huán)境.

OrexinA；消化道；牦牛；黃牛

牦牛(Bos grunniens)是唯一適應青藏高原高寒、低氧、枯草期漫長等極端生態(tài)環(huán)境的半放野大型草食動物，其枯草期長達約8個月[1].促食欲素(Orexin)是由下丘腦外側(cè)區(qū)(LHA)合成和分泌的小分子神經(jīng)肽[2].Orexin家族有兩個亞型，即OrexinA和OrexinB，OrexinA具有調(diào)節(jié)動物的攝食攝水行為、內(nèi)臟活動及能量代謝等廣泛的功能[3].已有報道，不同物種間OrexinA的結(jié)構保守、功能相似，但在不同消化道不同部位的分布具有種間差異性[3-6]，這種差異決定了動物的攝食和代謝等生理特性.以往關于Orexin的研究主要集中于人或大小鼠等實驗動物[7-8].尚未見在牦牛消化道的相關研究.本研究以黃牛為對照，通過分析OrexinA在牦牛和黃牛消化道不同部位的分布特征及表達差異，探討OrexinA參與其食欲、能量代謝等生理活動的作用機制，為進一步研究青藏高原土著動物對極端生境適應的能量代謝調(diào)控提供參考.

1　材料和方法

1.1組織采集與處理

牦牛組織樣品于2014年10月取自甘肅瑪曲屠宰場(海拔約3 500m)，黃牛組織樣品于2014年10月取自甘肅臨夏屠宰場(海拔約1 300m).牛處死后立即取皺胃、賁門、幽門和十二指腸組織，生理鹽水清洗干凈后，用40g·L-1多聚甲醛固定液固定，4 ℃冰箱保存.

1.2免疫組織化學染色

上述固定的牦牛、黃牛的賁門、皺胃、幽門、十二指腸，行常規(guī)石蠟切片，片厚5μm.貼于用多聚賴氨酸處理好的載玻片上，參考文獻[9]采用SP法檢測賁門、皺胃、幽門、十二指腸中OrexinA蛋白的表達.切片經(jīng)梯度酒精脫蠟，枸櫞酸鹽熱修復，3%過氧化氫以消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉后，滴加兔抗OrexinA多克隆抗體(稀釋度：1∶200，武漢博士德生物工程有限公司)，陰性對照以PBS代替一抗，4 ℃過夜，用免疫組織化學試劑盒(SP-9001，北京中杉金橋生物技術有限公司)進行二、三抗孵育，DAB顯色(ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司)，蘇木精復染，中性樹膠封片.Olympus光學顯微鏡下區(qū)分觀察賁門區(qū)、皺胃區(qū)、幽門區(qū)、十二指腸區(qū)，觀察免疫陽性反應產(chǎn)物的表達.

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2　結(jié)果

牦牛和黃牛的胃是復胃，包括瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃.賁門為胃上端的入口，幽門為胃的遠端，續(xù)接十二指腸.免疫組化結(jié)果表明，在牦牛和黃牛的皺胃、幽門、賁門和十二指腸中均有OrexinA陽性反應產(chǎn)物的表達，但其表達特征不盡相同.

2.1牦牛和黃牛消化道不同部位OrexinA的分布

2.1.1OrexinA在賁門區(qū)中的表達 牦牛賁門組織分黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層.OrexinA的免疫反應產(chǎn)物主要表達于黏膜層賁門腺的壁細胞胞質(zhì)內(nèi)，壁細胞(Parietalcells，PC)胞體呈卵圓形，核大且呈橢圓形，位于細胞中部.其中賁門腺(Cardiacgland，CG)分為深、淺兩層，淺層腺為單管腺，開口于胃小凹.賁門腺導管呈長梭形，由單層矮柱狀細胞圍成；深層腺為復管泡狀腺，導管呈圓形，深層腺被結(jié)締組織分成許多腺小葉，腺小葉體積較大，多呈橢圓形(圖1A1)，腺泡由單層立方細胞圍成，核呈圓形，位于細胞中央.黃牛賁門區(qū)的組織特點與牦牛相似，但其淺層腺泡較小，而且OrexinA的表達高于牦牛(圖1A2).

2.1.2OrexinA在皺胃體中的表達牦牛和黃牛的皺胃中存在大量的免疫反應陽性細胞，位于黏膜層胃腺的頸部和底部細胞的細胞質(zhì)中，細胞呈圓形、卵圓形，細胞核明顯(圖1B1).黃牛皺胃OrexinA的表達量明顯高于牦牛(圖1B2).

2.1.3OrexinA在幽門區(qū)中的表達牦牛幽門區(qū)的固有層內(nèi)分布大量幽門腺，此區(qū)的胃小凹很淺，為多分支的管狀粘液性腺，細胞多呈錐形，核為橢圓形，位于細胞基底部.牦牛幽門腺被結(jié)締組織分為多個小葉.腺泡多為圓形或卵圓形，腺腔較大(圖1C1).與牦牛相比，黃牛腺泡的體積比牦牛大，但是腺泡的數(shù)量明顯少于牦牛(圖1C2).牦牛和黃牛的OrexinA陽性表達均主要位于腺細胞的細胞質(zhì).

2.1.4OrexinA在十二指腸區(qū)中的表達在十二指腸中，牦牛的OrexinA陽性細胞主要分布于腺體細胞中，在其他固有層細胞(如肌肉細胞)中也散在分布(圖1D1).黃牛十二指腸內(nèi)OrexinA的表達部位與牦牛相同，但是表達量明顯高于牦牛(圖1D2).

2.2牦牛和黃牛OrexinA的免疫組織化學檢測結(jié)果對比分析

免疫組織化學圖像分析結(jié)果如表1所示，在牦牛和黃牛的胃腸道中，OrexinA陽性反應產(chǎn)物的平均吸光度從高到低依次為：皺胃體>幽門區(qū)>賁門區(qū)>十二指腸區(qū)(P<0.01)；黃牛賁門、皺胃、幽門和十二指腸OrexinA陽性反應產(chǎn)物的平均吸光度顯著高于牦牛的相應部位的表達(P<0.01).

表1　牦牛和黃牛賁門、皺胃、幽門、十二指腸的Orexin A陽性反應產(chǎn)物的平均吸光值

注：*P<0.05為差異顯著；**P<0.01為差異極顯著.

A1,B1,C1,D1分別為OrexinA在牦牛賁門、皺胃、幽門、十二指腸中的表達；A2,B2,C2,D2分別為OrexinA在黃牛賁門、皺胃、幽門、十二指腸中的表達；標尺為40μm

A1,B1,C1,D1istheexpressionofOrexinAinthecardia，abomasums，pyloriandduodenumrespectivelyinyak；A2,B2,C2,D2istheexpressionofOrexinAinthecardia，abomasums，pyloriandduodenumrespectivelyincattle.Thebaris40μm

3　討論

有研究表明，在人、猴、豬、綿羊、犬、貓、大鼠等動物中OrexinA神經(jīng)元胞體的分布存在種間差異，但主要分布在下丘腦外側(cè)區(qū)，其纖維廣泛地投射于其他腦區(qū)和脊髓[3,10-13].Orexin及其受體也廣泛存在于不同物種的外周器官，其表達細胞主要為內(nèi)分泌細胞，如胸交感干神經(jīng)節(jié)、胃、腸、甲狀腺、胰腺、腎臟、腎上腺、胎盤、睪丸、附睪、胎盤等[14-15].OrexinA不僅在外周器官有廣泛的調(diào)節(jié)作用，而且在中樞也參與對胃腸道生理活動的調(diào)節(jié).本研究表明，OrexinA陽性細胞在牦牛和黃牛的網(wǎng)胃和瓣胃均未表達，而在牦牛和黃牛的皺胃壁細胞、幽門、賁門和十二指腸的腺細胞均有表達，但其表達特征和表達量不同，其中在幽門部，牦牛OrexinA在腺細胞表達較黃牛少，而在腺細胞外表達較黃牛多，推測其肽能神經(jīng)末梢釋放的遞質(zhì)在神經(jīng)叢的傳遞中存在種間差異.

本研究表明牦牛胃組織和十二指腸中OrexinA陽性反應產(chǎn)物的平均吸光度極顯著地低于黃牛，這可能與Orexin參與機體攝食、能量代謝、心血管節(jié)律性、神經(jīng)內(nèi)分泌等密切相關.有研究發(fā)現(xiàn)Orexin可促進動物攝食，給雄鼠側(cè)腦室快速注入OrexinA能使動物呈現(xiàn)劑量依賴性促進攝食[3]；給斷奶1周的小豬注射OrexinB，其采食量比對照組增加了18%[16].Orexin也參與神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，腎上腺切除的大鼠PerpororexinmRNA的水平顯著下降，當給予地塞米松時,可以恢復到正常水平，表明Orexin參與對下丘腦一垂體一腎上腺(HPA)軸的調(diào)節(jié)[17]，可能在應激反應中起重要的作用.Oerxin對內(nèi)臟活動也有影響，給予大鼠不同劑量的OrexinA能依賴性促進其胃酸的分泌，阿托品或切斷迷走神經(jīng)就可以抵消這種作用[18]，表明OrexinA通過迷走神經(jīng)以劑量依賴方式影響大鼠胃酸分泌，推斷OrexinA可能是調(diào)節(jié)前期胃酸分泌的神經(jīng)遞質(zhì).而Orexin神經(jīng)纖維投射到與心血管活動調(diào)節(jié)有關的腦干區(qū)，充分表明Orexin參與心血管活動的調(diào)節(jié)，腦室內(nèi)注射OrexinA能使麻醉大鼠平均動脈壓和心率升高[19].研究表明下丘腦Orexin神經(jīng)元通過響應外周血液葡萄糖、瘦素以及胃饑餓素的代謝信號能直接感受有機體的營養(yǎng)狀況，而且通過自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)糖類物質(zhì)的利用，表明Orexin可能是作為一個主調(diào)節(jié)器來調(diào)節(jié)中樞與外周組織的激素水平，進一步維持整個機體的能量代謝平衡[20].牦牛生活在青藏高原高寒地帶，牧草生長季只有4—5個月，而枯草季長達7—8個月.筆者采樣是在10月下旬，已經(jīng)進入枯草期，這時牦牛下丘腦OrexinA神經(jīng)元能精確地感應到外周組織的不良營養(yǎng)狀況，所以分泌的OrexinA減少，借以通過改變自主神經(jīng)平衡來調(diào)節(jié)機體能量代謝的平衡.而黃牛是圈養(yǎng)家畜，不存在食物短缺的現(xiàn)象，故其體內(nèi)OrexinA的表達沒有明顯的變化.

綜上所述，OrexinA在牦牛和黃牛的皺胃、幽門、賁門和十二指腸均有表達，而在枯草季節(jié)，放養(yǎng)的牦牛由于食物短缺，可通過減少OrexinA來調(diào)節(jié)中樞及外周組織激素水平，從而維持機體能量代謝水平，適應青藏高原的特殊環(huán)境，但其具體調(diào)控機理有待進一步的研究.

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(責任編輯俞詩源)

Differential expression of Orexin Aingastrointestinaltractbetweenyakandcattle

DINGYan-ping1,MENGYuan1,ZHANGJin-ping1,SHAOBao-ping2

(1.SchoolofLifeScience,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,Gansu,China;2.CollegeofLifeSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,Gansu,China)

ToexploretheregulationeffectofOrexinAonenergymetabolismofyakbyanalyzingthedifferenceofdistributionandexpressioningastrointestinaltractbetweenyakandcattle.ImmunohistochemistryisusedtolocalizetheexpressionofOrexinAinthegastrointestinaltractoftheyak,Image-ProPlus6.0softwareisusedtosemi-quantitativeanalysetheintensityofexpressionofOrexinA.ResultsshowthatOrexinAiswidelyexpressedintheabomasum,pylorusandduodenumcardiainyakandcattle,whichhavedifferentexpressionalcharacteristics;ThemeanabsorbanceofOrexinApositivereactionproductinstomachtissueandduodenumofyakissignificantlylowerthanthatofcattle(P<0.01);BycomparingthemeanabsorbanceofOrexinApositivereactionproductintheyak,itisfoundthatitsexpressionfromstrongtoweaksuccessivelyisabomasumsarea,pyloricregion,cardiacregion,andthenduodenumarea(P<0.01).ItindicatsthatthelowerexpressionofOrexinAcouldregulatethehormonelevelsinthecentralandperipheraltissuestomaintainitsenergybalancetoadapttotheextremeenvironmentoftheTibetanplateau.

OrexinA；gastrointestinaltract；yak；cattle

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.03.019

2016-01-15;修改稿收到日期:2016-04-01

國家自然科學基金資助項目(31060141,31000190)

丁艷平(1980—)，女，副教授，博士，碩士研究生導師.主要研究方向為發(fā)育神經(jīng)生物學.

E-mail:dingyp05@163.com

Q946

A

1001-988Ⅹ(2016)03-0101-05