楊穎麗,馬 婷,呂麗榮,李翠祥,滕玉瑾
(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)
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鹽脅迫對黃花補血草幼苗葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的影響
楊穎麗,馬婷,呂麗榮,李翠祥,滕玉瑾
(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州730070)
以鹽生植物黃花補血草幼苗為供試材料,研究了不同濃度NaCl(0,25,50,100,150mmol·L-1)脅迫下葉片抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)中抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性的變化.結(jié)果顯示:150mmol·L-1NaCl處理誘導(dǎo)幼苗葉片AsA和總抗壞血酸含量增加;所有鹽濃度誘導(dǎo)脫氫抗壞血酸(DHA)含量、GSH/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值升高,谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸酶(AAO)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性增強,而AsA/DHA比值、GSSG含量和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性降低.此外,低濃度鹽脅迫下幼苗葉片GSH含量升高,而高濃度鹽處理誘導(dǎo)葉片GSH含量降低.表明鹽脅迫下黃花補血草幼苗葉片提高了非酶抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性,增強了幼苗清除活性氧的能力,增強了對鹽脅迫的耐受能力.
鹽脅迫;黃花補血草;抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán);活性氧
黃花補血草(Limonium aureum(L)Hill)又稱黃花磯松、金色補血草、金匙葉草,是藍雪科補血草屬多年生泌鹽植物,具有耐干旱、耐鹽堿、耐土壤瘠薄的優(yōu)良特性,多分布于我國呼倫貝爾沙地、騰格里沙漠地區(qū)、甘肅河西走廊沙地和蘭州等地[1-2].該物種具有良好的經(jīng)濟價值,在保護生態(tài)環(huán)境方面也有很好的生態(tài)價值[3].目前,關(guān)于黃花補血草的組織培養(yǎng)[4]、化學(xué)成分[5]、器官結(jié)構(gòu)解剖學(xué)[6]等方面有較多的研究報道.我們在研究中發(fā)現(xiàn),黃花補血草在鹽脅迫下通過積累滲透調(diào)節(jié)物和提高抗氧化酶活性,使其具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力,從而增強對鹽環(huán)境的適應(yīng)性[7].但有關(guān)鹽脅迫對黃花補血草抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-DSH)循環(huán)影響的研究報道較少.
土壤鹽漬化問題廣泛存在于我國的西北地區(qū),可導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化,并使農(nóng)作物的生長速率降低,農(nóng)作物產(chǎn)量減少.鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子,也是阻礙農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的主要因素之一[8].植物受到鹽脅迫時會產(chǎn)生大量的活性氧自由基,引起膜脂過氧化傷害.活性氧如不能被及時清除就會造成氧化脅迫,影響植物正常的生理功能[9].植物體可通過維持AsA-GSH循環(huán)的快速有效運轉(zhuǎn),減輕逆境脅迫下植物的活性氧傷害[10].AsA和GSH為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的抗氧化劑型非酶組成成分,而谷胱甘肽還原酶(GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)為該系統(tǒng)中重要的酶促組成成分,在增強植物的抗氧化防御系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要的作用.除此之外,氧化型谷胱甘肽(GSSG)在GR的催化作用下生成GSH,而抗壞血酸酶(AAO)則是依賴于AsA的活性氧清除劑[11].本研究以黃花補血草幼苗為供試材料,探究鹽脅迫對黃花補血草幼苗葉片內(nèi)AsA-GSH循環(huán)中抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響,旨在進一步了解鹽脅迫下植物體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)的變化機制,為研究植物耐鹽性的生理機制奠定基礎(chǔ).
1.1植物材料的培養(yǎng)及處理
將籽粒飽滿的黃花補血草(Limonium aureum(Linn)Hill)種子(由甘肅省民勤縣沙生植物園提供)浸泡在10%的次氯酸鈉溶液中10min,并分別用無菌水沖洗3次,75%的乙醇浸泡約30s,無菌水連續(xù)沖洗5~7次后,將種子移到1/4Hoagland固體培養(yǎng)基中,在其萌發(fā)4d后,挑選生長程度接近的幼苗依次轉(zhuǎn)入含有0,25,50,100和150mmol·L-1NaCl的1/4Hoagland固體培養(yǎng)基上(每個處理設(shè)3個重復(fù)),置于恒溫光照培養(yǎng)箱中,光暗周期12h/12h,光照強度1 500~2 000lx,晝夜溫度(25±2)℃,處理21d后取葉片進行各生理指標的檢測.
1.2AsA,DHA和總抗壞血酸(AsA+DHA)含量的測定
參照Kampfenkel等[12]的方法測定AsA和AsA+DHA含量.1g幼苗葉片加入4mL6%的三氯乙酸(TCA)冰浴研磨,13 000r·min-1離心10min后,提取上清液備用.AsA含量檢測時,取0.2mL上清液依次加入0.6mL0.2mol·L-1磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)、0.2mLH2O、1.0mL10%TCA、0.8mL42%磷酸和0.8mL4%2,2′-聯(lián)吡啶,最后加入3%三氯化鐵(FeCl3),42 ℃水浴40min后于525nm處測定OD.AsA+DHA含量測定時,在0.2mL上清液中依次加入0.2mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)和0.4mL0.2mol·L-1PBS(pH7.4),于42 ℃水浴15min,加入0.2mL0.5%N-乙基馬來酰亞胺(NEM),室溫放置1min,而后重復(fù)AsA含量的檢測方法,以nmol·g-1鮮重(FW)為單位.DHA的含量為AsA+DHA和AsA的差值,并計算AsA/DHA比值.
1.3GSH和GSSG含量的測定
依據(jù)Hissin和Hilf[13]的方法,用熒光光度計檢測GSH和GSSG含量,1g葉片加入3.75mL0.1mol·L-1PBS(pH8.0,含有5mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA))和1mL25%磷酸,冰浴研磨,并以15 000r·min-1離心30min.GSH測定時,0.5mL上清中加入4.5mL0.1mol·L-1PBS(pH8.0,含有5mmol·L-1EDTA),取稀釋的上清100μL,加入1.8mL0.1mol·L-1PBS(pH8.0,含有5mmol·L-1EDTA)和100μL0.1%的鄰苯二甲醛,混勻后室溫放置15min,于420nm發(fā)射光和350nm激發(fā)光下測定熒光值.GSSG測定時,在0.5mL上清中加入200μL0.04mol·L-1NEM,室溫放置30min后,加入4.3mL0.1mol·L-1NaOH,混勻后于420nm發(fā)射光和350nm激發(fā)光下測定熒光值.GSH和GSSG含量均以ng·mg-1FW為單位.
1.4GR,AAO,MDHAR和DHAR活性的測定
參照Foster[14]的方法檢測GR的活性.0.5g葉片,加入2mL50mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5,含0.1mmol·L-1EDTA和0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)),12 000r·min-1離心30min,取上清液150μL加入3mL50mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5,含3mmol·L-1MgCl2,0.5mmol·L-1GSSG和0.15mmol·L-1NADPH)中,混勻后立即于340nm處以30s為間隔做3min時間掃描.以1min內(nèi)OD340值變化的0.1為一個酶活單位(U).
參照Shen等[15]的方法檢測AAO的活性.1g葉片材料加入4mL50mmol·L-1PBS(pH7.2,含2mmol·L-1EDTA,2mmol·L-1DTT,20%甘油和2%PVP),10 000r·min-1離心30min,上清液用于檢測蛋白含量.AAO測定時,取0.1mL上清加入2.5mL50mmol·L-1PBS(pH5.6,含1mmol·L-1AsA和5mmol·L-1EDTA),混勻后在265nm處以20s為間隔做2min時間掃描.以1min內(nèi)OD265值變化的0.1為一個酶活單位(U).參照Ma和Cheng[16]的方法檢測MDHAR和DHAR的活性.MDHAR測定時,0.1mL上清中加入2.9mL50mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.6,含0.1mmol·L-1NADH,0.25mmol·L-1AsA和0.3U抗壞血酸氧化酶),混勻后于340nm處以20s為間隔做2min時間掃描.以1min內(nèi)OD340值變化的0.01為一個酶活單位(U).DHAR測定時,取0.1mL上清加入2.9mL100mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.0,含2.5mmol·L-1GSH和0.6mmol·L-1DHA),混勻后于265nm處以20s為間隔做2min時間掃描.以1min內(nèi)OD265值變化的0.01為一個酶活單位(U).
以上酶活性單位均用U·mg-1protein表示.
1.5蛋白含量的測定
參照Bradford[17]的方法檢測蛋白含量,在波長595nm處測定吸光值,并以牛血清白蛋白為標準計算蛋白含量.
1.6數(shù)據(jù)分析
利用SPSS17.0進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,并用Excel和CorelDraw9.0進行制圖與圖表處理.每個處理均設(shè)置3個重復(fù),數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示,用Duncan多重比較的方法進行差異顯著性檢驗分析,檢驗顯著性水平為0.05.
2.1鹽脅迫對黃花補血草幼苗葉片AsA,DHA,AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的影響
如表1所示,在25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫下,黃花補血草幼苗葉片中AsA含量沒有顯著變化,而在最高濃度150mmol·L-1NaCl處理下,葉片中AsA的含量顯著增加,相比于對照組升高了19.51%.
幼苗葉片中DHA的含量與對照組相比均有不同程度的升高,并分別升高了8.96%,11.94%,2.99%和20.90%(表1),可見在150mmol·L-1NaCl脅迫下這一趨勢較為顯著.
幼苗葉片中AsA+DHA含量在25和50mmol·L-1NaCl脅迫下沒有明顯的變化,而在100mmol·L-1NaCl脅迫下減小,150mmol·L-1NaCl脅迫下增大,與對照組相比分別變化了6.71%和20.13%(表1).
由表1可知,25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫誘導(dǎo)幼苗葉片的AsA/DHA比值顯著降低,而150mmol·L-1NaCl脅迫不影響AsA/DHA比值.
2.2鹽脅迫對黃花補血草幼苗葉片GSH,GSSG含量和GSH/GSSG比值的影響
由圖1A可知,鹽脅迫誘導(dǎo)黃花補血草幼苗葉片中的GSH含量呈先升高后降低的變化趨勢.與對照組相比較,25和50mmol·L-1NaCl處理誘導(dǎo)幼苗葉片中GSH含量分別升高約4.9%和16.99%,而在100和150mmol·L-1NaCl處理下,幼苗葉片中GSH含量分別降低約15.59%和16.46%.不同的是,幼苗葉片中的GSSG含量在鹽處理下呈現(xiàn)逐漸減小的變化趨勢(圖1B),在25,50,100和150mmol·L-1NaCl處理下,較對照組分別降低約13.42%,20.13%,28.19%和28.86%.此外,所有鹽濃度均導(dǎo)致幼苗葉片的GSH/GSSG比值升高,且在50mmol·L-1NaCl處理時達到最大值(圖1C).
表1 不同濃度NaCl對黃花補血草幼苗葉片AsA,DHA,AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的影響
注:不同字母表示差異顯著P<0.05.
圖1 不同濃度NaCl對黃花補血草幼苗葉片GSH、GSSG和GSH/GSSG比值的影響Fig 1 Effects of different NaCl concentrations on GSH,GSSG and GSH/GSSG in L aureum seedling leaves
2.3鹽脅迫對黃花補血草幼苗葉片GR,AAO,MDHAR和DHAR活性的影響
由表2可知,所有鹽濃度誘導(dǎo)黃花補血草幼苗葉片GR活性顯著增強,此效應(yīng)具有濃度依賴性.與未處理幼苗相比,25,50,100和150mmol·L-1NaCl脅迫誘導(dǎo)幼苗葉片中的GR活性分別增強約1.76倍、1.76倍、2.24倍和4.59倍.
黃花補血草幼苗葉片的AAO活性在25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫下顯著增強,且分別升高為對照組的1.67倍、1.84倍和1.42倍,但在最高濃度(150mmol·L-1)NaCl處理時與對照比沒有明顯變化(表2).
幼苗葉片的MDHAR活性在鹽處理下較對照均有所降低,但50mmol·L-1NaCl處理時的變化與對照比無明顯差異,而25,100和150mmol·L-1NaCl處理下分別降低約45.4%,49.58%和70.08%.
所有鹽脅迫均誘導(dǎo)幼苗葉片DHAR的活性顯著增強,且在25,50,100和150mmol·L-1NaCl脅迫下,分別增強為對照組的1.63倍、3.81倍、3.75倍和2.43倍.
表2 不同濃度NaCl對黃花補血草幼苗葉片GR,AAO,MDHAR和DHAR活性的影響
注:不同字母表示差異顯著P<0.05.
鹽脅迫對植物的破壞作用主要是通過滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)失衡,并導(dǎo)致鹽脅迫的次級反應(yīng)如氧化脅迫等的產(chǎn)生[18].AsA-GSH在植物抵抗氧化脅迫、清除活性氧自由基方面具有重要作用[10],其中AsA含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA比值)及其相關(guān)代謝合成酶的活性變化與植物對生態(tài)環(huán)境脅迫的響應(yīng)息息相關(guān)[19].鹽處理(NaCl)羅勒葉片30d后,對AsA+DHA含量沒有影響,且葉片內(nèi)AsA含量和AsA/DHA比值保持不變[20].而NaCl脅迫下番茄幼苗葉片AsA含量顯著提高,AsA/DHA比值降低[21].本研究中NaCl脅迫下黃花補血草幼苗葉片AsA,DHA和AsA+DHA的含量在25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫下并沒有發(fā)生明顯變化,而在最高濃度(150mmol·L-1)處理時均明顯升高,但AsA/DHA比值在25,50和100mmol·L-1NaCl處理時均顯著低于對照組(表1).表明高濃度鹽脅迫下黃花補血草幼苗通過增加葉片中AsA和DHA的積累,調(diào)節(jié)葉片內(nèi)的氧化還原狀態(tài)來響應(yīng)鹽脅迫,使幼苗的抗逆境脅迫能力增強.
GSH與AsA都是植物調(diào)節(jié)細胞功能的必需代謝物,在植物抗氧化防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22].有研究者指出,AsA/DHA和GSH/GSSG的比值變化可能與植物的耐鹽性有關(guān),有助于植物有效防止氧化損傷,在植物細胞抵抗氧化應(yīng)激方面比AsA和GSH的含量更具有重要意義[23].鹽脅迫導(dǎo)致葡萄葉片中GSH含量、GSH/GSSG比值明顯降低,而GSSG含量明顯升高[24].而水稻幼苗葉片中GSH含量在150 和250mmol·L-1NaCl脅迫下顯著增加,GSH/GSSG比值在兩種鹽濃度處理下顯著下降[25].本研究中黃花補血草幼苗葉片GSH含量在低濃度(25和50mmol·L-1)NaCl脅迫下升高,而高濃度(100和150mmol·L-1)NaCl脅迫下降低,此外,所有鹽濃度均誘導(dǎo)幼苗葉片GSH/GSSG比值的升高,此效應(yīng)在(25和50mmol·L-1)NaCl處理時更加顯著,但幼苗葉片中GSSG含量在鹽脅迫下呈下降趨勢.這些結(jié)果表明,在鹽脅迫下黃花補血草幼苗葉片通過提高GSH的含量和GSH/GSSG的比值,并降低GSSG的含量,來維持細胞相對穩(wěn)定的氧化還原平衡,增強幼苗清除活性氧的能力,從而提高了植株抗鹽脅迫的能力,緩解了鹽脅迫對幼苗造成的傷害,而高鹽濃度下GSH含量降低可能是由于GSH的合成代謝過程受到了破壞.
鹽脅迫下植株體內(nèi)會產(chǎn)生大量自由基引起植株代謝失衡,AsA和GSH在鹽脅迫下的再生,使得AsA-GSH循環(huán)快速高效運轉(zhuǎn),進而維持了植物較強的氧化還原力和高水平的抗氧化物質(zhì),使過量產(chǎn)生的活性氧可以及時被清除[26].GR,AAO,MDHAR和DHAR是AsA-GSH系統(tǒng)中重要的酶促組成成分,控制著植物細胞中抗壞血酸的含量.文獻報道,鹽處理增強了菜豆葉片GR的活性,降低了其葉片MDHAR和DHAR的活性.不同的是,水稻幼苗葉片的GR,MDHAR和DHAR活性在鹽脅迫下均逐漸增強[23,25].除此之外,非生物脅迫誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片中AAO活性增強,隨著脅迫時間的延長,酶活性又慢慢降低[11].本實驗鹽脅迫誘導(dǎo)黃花補血草幼苗葉片GR和DHAR的活性增強,MDHAR活性降低,而幼苗葉片AAO的活性在25,50和100mmol·L-1NaCl條件下顯著增強,但150mmol·L-1NaCl處理不影響AAO的活性.這些結(jié)果表明,GR活性的增強有效實現(xiàn)了黃花補血草幼苗體內(nèi)AsA的再生,在清除活性氧的過程中起到重要的作用.此外,在AsA-GSH循環(huán)中,AsA也可通過MDHAR和DHAR利用NADPH和GSH作為電子供體由DHA再生[25].因此,黃花補血草幼苗葉片中較高的DHAR活性保證了幼苗葉片中AsA含量的增加,促進了AsA的再生,實現(xiàn)抗壞血酸的循環(huán)再利用,而幼苗葉片AAO活性的增強賦予了幼苗在鹽脅迫下較強的活性氧清除能力.由此可見,保持較高的抗氧化酶活性可清除過量活性氧,且能較好地維持AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的完整性,這也可能是黃花補血草幼苗耐NaCl脅迫的主要原因之一.
綜上可知,鹽脅迫下黃花補血草幼苗葉片可能通過提高非酶抗氧化物質(zhì)AsA,GSH含量和GSH/GSSG比值,并增強GR,DHAR和AAO等抗氧化酶活性,進而增強幼苗的抗氧化能力,緩解了NaCl對幼苗造成的氧化損傷.
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(責(zé)任編輯俞詩源)
Effects of salinity stress on ascorbate-glutathione cycleintheleavesofLimonium aureum(L)Hillseedlings
YANGYing-li,MATing,LüLi-rong,LICui-xiang,TENGYu-jin
(CollegeofLifeScience,NorthwestNormalUniversity.Lanzhou730070,Gansu,China)
HalophyteLimonium aureum(L)Hillseedlingsareusedtoinvestigatethechangesofantioxidantsubstancecontentsandantioxidantenzymeactivitiesassociatedwithascorbate-glutathione(AsA-GSH)cycleinresponestodifferentNaClconcentrations(0,25,50,100,150mmol·L-1).Theamountofascorbicacid(AsA)andtotalascorbicacidcontentsriseduetoonly150mmol·L-1NaCl.Differently,allsalinityconcentrationsleadtotheincreasesofdehydroascorbate(DHA)content,GSH/oxidizedglutathione(GSSG)andglutathionereductase(GR),ascorhicoxidas(AAO)anddehydroascorbatereductase(DHAR)activities,butthedecreasesofAsA/DHA,GSSGlevelandmonodehydroascorbatereductase(MDHAR)activities.Inaddition,GSHcontentincreasesinresponsetolowNaClconcentrationsbutdecreasestohighsalinityintheleavesofLimonium aureum(L)Hillseedlings.Takentogether,salinitystressresultsintheincreasesofnon-enzymaticantioxidantlevelsandantioxidantenzymeactivitiesintheleavesofLimonium aureum(L)Hillseedlings,whichmightenhancetheabilityofreactiveoxygenspeciesscavengingandstrengthenseedlingresistancetosaltstress.
saltstress;Limonium aureum(L)Hill;ascorbate-glutathionecycle;reactiveoxygenspecies
10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.03.016
2015-10-20;修改稿收到日期:2015-11-12
國家自然科學(xué)基金資助項目(31360094,31470464)
楊穎麗(1971—),女,甘肅漳縣人,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師.主要研究方向為植物生理與分子生物學(xué).
E-mail:yangyingli2006@sohu.com
S512.1+2
A
1001-988Ⅹ(2016)03-0084-06