馬玉英

（寧夏賀蘭縣農(nóng)牧漁業(yè)局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 賀蘭 750200）

試驗(yàn)研究

嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）總抗體檢測試劑盒（ELISA）的研制

馬玉英

（寧夏賀蘭縣農(nóng)牧漁業(yè)局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 賀蘭 750200）

為建立檢測嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）血清總抗體的雙抗原夾心ELISA方法并進(jìn)行初步試用，通過原核表達(dá)得到SFTSV-NP重組蛋白，以該蛋白作為ELISA的包被和酶標(biāo)記抗原，確定抗原的最佳包被濃度和血清稀釋度，優(yōu)化各項(xiàng)試驗(yàn)條件，在此基礎(chǔ)上研制試劑盒，并對試劑盒的重復(fù)性、特異性等方面進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原最適包被濃度為4.0 μg/ml，血清的最佳稀釋濃度為1∶40，重復(fù)性試驗(yàn)表明批內(nèi)和批間的變異性都低于10%。該試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性良好，可應(yīng)用于SFTSV的研究和臨床檢測。

嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒；抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

近幾年來，我國湖北、河南、山東等地相繼發(fā)現(xiàn)一些以發(fā)熱伴血小板減少為主要表現(xiàn)的感染性疾病病例，該病的主要傳播途徑為蜱蟲的叮咬。2010年5月，中國疾病預(yù)防控制中心將該病毒引起的病例定義為“嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征”，并開展了病例的主動發(fā)現(xiàn)、搜索等監(jiān)測工作［1-2］。從病人血清中分離到1株病毒，并完成了病毒的全基因序列測定和同源性比較，通過對病毒基因結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征的詳細(xì)分析，確定該病毒為一種新型布尼亞病毒［3］。2011年3月17日出版的國際權(quán)威醫(yī)學(xué)刊物《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》刊登了該研究成果，這是國際上首次報(bào)道這一布尼亞科病毒。

到目前為止，該病毒的檢測方法還很有限，主要有PCR檢測、免疫熒光檢測（IFA）、血清學(xué)檢測、電子顯微鏡檢測等［4］。然而這幾種檢測方法均存在一些缺陷，如病毒核酸檢測程序繁瑣，耗時(shí)耗力且對儀器的要求高，電子顯微鏡檢測費(fèi)用高且檢測靈敏度低，要求檢測者有熟練的技術(shù)［5］，不利于SFTSV的快速檢測和診斷。研制操作簡便、敏感性高、特異性好、能快速診斷SFTSV的試劑盒和監(jiān)測方法十分必要。該項(xiàng)目以ELISA雙抗原夾心法，檢測患者血清中是否存在SFTSV抗體，以確定患者是否感染或曾經(jīng)感染過SFTSV，從而為臨床診斷提供幫助。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒、血清

SFTSV毒株、陽性血清均由江蘇疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所保存。

1.1.2引物、原核表達(dá)載體

引物、原核表達(dá)載體pET28a-NP均由江蘇疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所構(gòu)建。

1.1.3試劑及主要儀器

病毒TRNA提取試劑Trizol、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）、弗氏完全、不完全佐劑購自美國Sigma公司；PCR儀：德國Biometra公司產(chǎn)品；恒溫儀、離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DEM-Ⅱ自動酶標(biāo)洗板機(jī)：北京拓普生產(chǎn)；MODEL 680型酶標(biāo)儀；96孔可拆式ELISA酶標(biāo)板：丹麥NUNC公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1制備重組抗原

根據(jù)Trizol試劑說明書從血清中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出SFTSV-NP基因，分別用限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I酶切上述擴(kuò)增片段與質(zhì)粒pMD18-T，回收目的基因和載體片段，進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌E.coli DE3，挑取經(jīng)酶切鑒定的單個(gè)白色菌落，37℃培養(yǎng)至OD600 nm為0.4～0.6時(shí)，加ITPG 37℃誘導(dǎo)6 h，收集菌體，純化目的蛋白，具體操作步驟參考文獻(xiàn)［6-8］。

1.2.2酶標(biāo)記抗原

對表達(dá)純化的NP重組蛋白采用過碘酸鈉法標(biāo)記辣根過氧化物（HRP），經(jīng)Supperdex 200分子篩分離純化，方法參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.3ELISA各項(xiàng)試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.2.3.1ELISA抗原包被濃度和血清稀釋度確定

以方陣滴定試驗(yàn)檢測抗原的最佳包被濃度和血清最適稀釋度。橫排為不同稀釋濃度的重組蛋白（8.0 μg/ml、6.0 μg/ml、4.0 μg/ml、2.0 μg/ml、1.0 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml），縱排分別加入1∶20、1∶40、1∶80、1∶160倍比稀釋的SFTSV陽性血清和陰性血清。計(jì)算陽性血清孔的平均OD450 nm值（P）和陰性血清孔的平均OD450 nm值（N）之比（P/N），比值最大孔的抗原濃度和血清稀釋倍數(shù)即為最佳。

1.2.3.2酶標(biāo)抗原的最佳使用濃度

將酶標(biāo)抗原進(jìn)行不同濃度的稀釋，各取1滴加入系統(tǒng)采用的1 ml底物液中，迅速混勻后觀察顏色變化，在1～1.5 min內(nèi)出現(xiàn)明顯顏色變化的二抗?jié)舛?，也就是最佳的酶?biāo)抗原使用濃度。

1.2.3.3在已確定的各種條件下，選擇適合的封閉液和稀釋液

分別用5%～10%脫脂奶粉、5%～10%馬血清、1%白明膠、1%BSA作封閉液；用1%～5%脫脂乳、3%～5%馬血清、0.1%白明膠、0.1%BSA作稀釋液，測450 nm的OD值，選本底值、P/N值大、OD值最高者為最適。

1.2.3.4各個(gè)步驟作用時(shí)間的選擇（選擇本底值低、P/N比值最高者為最適作用時(shí)間）

包被條件：其他條件不變，選4℃過夜、37℃作用1 h 后4℃過夜、37℃作用2 h，這3個(gè)梯度；

封閉時(shí)間：設(shè)0.5 h、1 h、2 h、4 h，共4個(gè)梯度；

血清樣品反應(yīng)時(shí)間：設(shè)10 min、20 min、30 min、40 min，共4個(gè)梯度；

酶標(biāo)抗原作用時(shí)間：設(shè)30min、1h、2h，共3個(gè)梯度；

顯色時(shí)間：設(shè)顯色時(shí)間分別為5 min、8 min、10 min、12 min、14 min，共5個(gè)梯度。

1.2.3.5臨界值的確定

隨機(jī)挑取SFTSV抗體陽性血清20份，抗體陰性血清80份，以優(yōu)化的抗原包被量和血清工作濃度對血清進(jìn)行ELISA檢測，測定450 nm的OD值，計(jì)算陰性血清的平均OD值（）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），求得陰陽性判定界限x±3SD。

1.2.4試劑盒總體性能評價(jià)

1.2.4.1特異性試驗(yàn)

用組裝完成的試劑盒對可以引起出血熱的病毒、細(xì)菌進(jìn)行檢測（例：腎綜合征出血熱（HERS）病毒、流感病毒、鉤端螺旋體），同時(shí)選20份SFTSV陰性血清，對試劑盒的特異性進(jìn)行檢測。

1.2.4.2敏感性試驗(yàn)

其他反應(yīng)條件均在最適的情況下，將陽性血清1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120稀釋8個(gè)梯度進(jìn)行ELISA檢測。

1.2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)

批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：在同一批次內(nèi)隨機(jī)挑選5塊ELISA試劑盒檢測已知背景的血清5份（陽性血清3份，陰性血清2份），計(jì)算“批內(nèi)變異系數(shù)”。

批間重復(fù)試驗(yàn)：在不同批次隨機(jī)抽取5個(gè)ELISA試劑盒檢測已知背景的血清5份（陽性血清3份，陰性血清2份），計(jì)算“批間變異系數(shù)”。

2　結(jié)果

2.1重組抗原制備

原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NP轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得表達(dá)蛋白與預(yù)期大小相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后純化獲得了較高純度的目的蛋白。

2.2ELISA各項(xiàng)試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

從方陣滴定法檢測結(jié)果表1可以看到，隨著包被抗原濃度的減少和血清稀釋倍數(shù)的增加，血清的OD值不斷降低，當(dāng)抗原包被濃度在4 μg/ml，血清稀釋倍數(shù)為1∶40時(shí)，陽性血清的OD值在1.0左右，且陰性血清的OD值低，陽性陰性血清比值（P/N）高。一般情況下，ELISA檢測儀在檢測OD值為1.0左右時(shí)誤差最小，反應(yīng)最靈敏，以此為根據(jù)，選擇4 μg/ml的抗原包被量為最適包被濃度，而被檢血清的最佳稀釋為1∶40。

當(dāng)酶標(biāo)抗原NP-HRP稀釋到1∶1 000時(shí)與底物反應(yīng)能在1～1.5 min內(nèi)出現(xiàn)明顯的顏色變化，因此將酶標(biāo)抗原的工作濃度定為1∶1 000。封閉效果最好的是10%脫脂乳；0.1%BSA為樣品稀釋液；包被時(shí)間為37℃水浴2h；4℃封閉過夜；待檢血清在37℃作用30 min及；酶標(biāo)抗原在37℃作用20 min；5～8 min為最適宜顯色時(shí)間。

表　方陣滴定法確定抗原最適包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)

2.3ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

試驗(yàn)測得陰性血清OD450 nm均值范圍為0.12±0.03，在此基礎(chǔ)上確定該ELISA試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N＞2.1，且陽性血清A450 nm＞0.25時(shí)則待檢血清SFTSV總抗體為陽性。

2.4特異性試驗(yàn)

對其有出血熱癥的陽性血清和20份陰性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2.5敏感性試驗(yàn)

通過檢測倍比稀釋的陽性血清，結(jié)果顯示當(dāng)血清稀釋濃度達(dá)到1∶640時(shí)，按以上判定標(biāo)準(zhǔn)判定仍為陽性，說明該試劑盒的靈敏度為1∶640.

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

用同一批次和不同批次的ELISA試劑盒對已知背景的5份血清（陽性血清3份，陰性血清2份）作批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算得出“批內(nèi)重復(fù)系數(shù)”在2.53%～5.62%，“批間重復(fù)系數(shù)”在4.17%～5.89%，重復(fù)系數(shù)都小于10%，說明試劑盒的重復(fù)性良好。

3　討論

嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒簡稱“新布尼亞病毒”，屬于布尼亞（Bunya）病毒科白蛉病毒屬［2］。病毒體呈球形，直徑80～100 nm，外有脂質(zhì)包膜，表面有棘突?；蚪M包含3個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段（L、M和S），L片段全長為6 368個(gè)核苷酸，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶；M片段全長為3 378個(gè)核苷酸，含有單一的讀碼框架，編碼1 073個(gè)氨基酸的糖蛋白前體；S片段是一個(gè)雙義RNA，基因組以雙向的方式編碼病毒核蛋白和非蛋白結(jié)構(gòu)［10］。病毒基因組末端序列高度保守，與白蛉病毒屬其他病毒成員相同，可形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)［1］。

該病毒從2010年9月到2011年3月，在中國湖北、河南、山東、江蘇、安徽和遼寧等6個(gè)省份導(dǎo)致至少36名患者死亡。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、消化道癥狀、血小板減少、白細(xì)胞減少、肝腎功能損害，部分患者有出血表現(xiàn)。該病主要發(fā)生在丘陵、山區(qū)，患者以從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成年農(nóng)民為主，部分患者被蜱叮咬。流行期為4～10月，流行高峰為5～7月［11］。

到目前為止SFTSV的研究還處于起步階段，國內(nèi)外對SFTSV的檢測主要包括兩方面：抗原檢測和抗體檢測?？乖瓩z測是通過電子顯微鏡和核酸測序；抗體檢測的方法主要有間接免疫熒光法（IFA），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），中和試驗(yàn)。通常應(yīng)用最為廣泛的是ELISA法，但是市場內(nèi)并沒有商品化的SFTSV抗體或試劑盒，要對SFTSV進(jìn)行檢測就必須經(jīng)過繁復(fù)的試驗(yàn)過程，且對儀器和檢測員的要求都很高。

該試驗(yàn)使用重組蛋白NP作為包被抗原和酶標(biāo)記抗原，建立了雙抗原夾心ELISA法，并對其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上研制出ELISA試劑盒。通過對試劑盒的檢測表明其特異性良好，未于布尼亞其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，并且ELISA方法的成功建立克服了其他檢測法存在的缺點(diǎn)，該試劑盒的檢出率高，費(fèi)用少，對儀器及檢驗(yàn)員的要求不高，為試劑盒的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南.北京：中國衛(wèi)生部辦公廳，2010.

［2］Yu XJ，Liang MF，Zhang SY，et al.Fever with Thrombocytopenia Associated with a Novel Bunyavirus in China［J］.N Engl J Med，2011，364：1523-1532.

［3］Zhang L，Liu Y，Ni D，et al.Nosocomial transmission of human granulocytic anaplasmosis in China［J］.JAMA，2008，300（19）：2263-2270.

［4］張麗敏.發(fā)熱伴血小板減少綜合征實(shí)驗(yàn)室檢測方案［N］.中國社區(qū)醫(yī)師，2010-10-24.

［5］李成，谷守林.快速檢測動物病毒電鏡技術(shù)［J］.中國畜禽傳染病，1997，19（6）：14-19.

［6］吳守麗，何似，李世清，等.雙抗原夾心法ELISA在腎綜合征出血熱診斷中的應(yīng)用［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2007，18（6）：492-494.

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［9］王學(xué)斌，劉鳳蓮，李東風(fēng).辣根過氧化物酶標(biāo)記技術(shù)的贗象［J］.生物技術(shù)，1998，8（4）：17-20.

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［11］陶文元，陶欣.新型布尼亞病毒感染致發(fā)熱伴血小板減少綜合征8例報(bào)告［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，21 （1）：91-92.

信息博覽

美國新技術(shù)可通過雞胚檢測分公母

據(jù)美國媒體報(bào)道，由于公雞無法產(chǎn)卵，美國雞蛋生產(chǎn)界一直有殺死已孵化小公雞的習(xí)慣，做法被指殘忍。但隨著辨認(rèn)胚胎性別的技術(shù)普及，有望于2020年前停止所有殺滅公雞的做法。

代表美國95%蛋農(nóng)的美國蛋農(nóng)聯(lián)合協(xié)會（United Egg Producers）宣布，有望在4年內(nèi)，停止所有殺滅公雞的做法。

協(xié)會會長格雷戈里（Chad Gregory）表示，希望引入辨識雞蛋內(nèi)胚胎性別的技術(shù)，以微型針頭插入雞蛋內(nèi)，抽取胚胎的DNA來檢測小雞的性別。若結(jié)果為雄性，就會跳過孵化程序，直接當(dāng)雞蛋供應(yīng)市場，以免小雞受到不必要的痛苦。

格雷戈里解釋，限期設(shè)于2020年，是因?yàn)樵摷夹g(shù)尚未能應(yīng)用于商業(yè)上。

英國退歐對美元的沖擊在牲畜市場中影響重大

史蒂夫·邁耶（Steve Meyer）和萊恩·施泰納（Len Steiner）寫道，這周包含夏至即一年中最長的一天。而且根據(jù)時(shí)間表上已經(jīng)出現(xiàn)的幾個(gè)潛在市場態(tài)勢判斷，這周對于期貨市場參與者是最長的1w。

周末集中出現(xiàn)了三份重要報(bào)告，每月活牛飼料庫存、紅肉與家禽冷藏庫存與季度生豬與仔豬庫存。這三份報(bào)告都會由美國農(nóng)業(yè)部在周末即6月24日公布。

英國退歐對于美國牲畜生產(chǎn)商來說，最重要的短期可能結(jié)果是美元價(jià)值所發(fā)生的改變與銷往海外的美國產(chǎn)品相對價(jià)格影響。

S851.4

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1004-5090（2016）07-0003-03

2016-05-13）