李獻文　仇鐵峰　丁明　金建華江蘇大學附屬武進人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，呼吸內(nèi)科，江蘇常州00江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇常州00

hTERT mRNA在肺癌中的作用△

李獻文1仇鐵峰2#丁明3金建華1
江蘇大學附屬武進人民醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2呼吸內(nèi)科，江蘇常州213002
3江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇常州212002

目的探討人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomeraseReverse transcriptase，hTERT）在肺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移中的診斷價值。方法選取確診為非小細胞肺癌（NSCLC）的患者40例，選擇同期診斷為肺部良性疾病的患者20例為研究對象，在未進行任何治療前收集各研究對象的外周血，實時熒光定量PCR方法檢測血hTERT mRNA并進行評價分析。結(jié)果①NSCLC患者外周血中hTERT mRNA相對表達量明顯高于肺良性疾病患者（P<0.05）；②40例NSCLC患者外周血中hTERT mRNA的陽性表達率分別為58.2%，20例肺良性疾病患者hTERT mRNA陽性表達率為5%，明顯低于肺癌組患者（均P＜0.001）；③經(jīng)分析，患者的hTERT mRNA與肺癌分期（TNM）具有顯著的關系（P=0.004），但是，患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤的組織學類型及分化程度對hTERT mRNA的表達無明顯相關性。結(jié)論外周血hTERT mRNA表達在肺癌細胞分子標志物的NSCLC臨床診斷中具有潛在的應用價值。

肺癌；hTERT

Key worddss::lung cancer;hTERT

Oncol Prog,2016,14(1)

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，且呈急劇上升趨勢。其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的80%，小細胞肺癌（SCLC）約占20%[1]。至2014年全球每年新增肺癌患者人數(shù)已達120萬，我國肺癌發(fā)病率每年增長26.9%，且自診斷為肺癌后，其5年生存率﹤15%[1-2]。雖然手術(shù)是治療NSCLC的主要方法，但65%的NSCLC患者在診斷時已存在遠處轉(zhuǎn)移，而20%的患者無轉(zhuǎn)移[3]。其中，Ⅰ期NSCLC患者中有30%～40%的患者接受根治性手術(shù)治療后均出現(xiàn)不同程度的復發(fā)狀況，并且最終導致死亡[4-5]。經(jīng)專家分析可知，其死亡?原因為癌細胞擴散至其他內(nèi)臟所致。

肺癌預后生物學因子，即腫瘤標志物在肺癌中已展開了廣泛研究，但仍未形成定論。端粒是維持真核系染色體末端完整及防止其異常的結(jié)構(gòu)。人端粒酶是由人端粒酶RNA，其相關蛋白和hTERT共同構(gòu)成。端粒酶存在于端粒的合成過程中，它是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，TTAGGG的合成就是依靠這種端粒酶進行合成的，其編碼基因主要位于3q26.3位置。端粒酶不僅作為一種逆轉(zhuǎn)錄酶而存在，且它在催化hTERT等方面還存在著顯著的作用。所以本研究就hTERT mRNA在肺癌中的作用進行深入的探討，以便為臨床提供指導，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1病例資料

選取自2011年7月至2012年6月于江蘇大學附屬醫(yī)院確診為NSCLC的患者40例作為肺癌組。肺癌組患者中，男性25例，女性15例，年齡為42～80歲，平均年齡65歲；年齡≥60歲的患者有25例，﹤60歲的患者有15例。對肺癌組40例患者采用國際抗癌協(xié)會2009年修訂的肺癌TNM分期標準進行評定，評定結(jié)果為：Ⅰ～Ⅱ期患者23例，Ⅲ～Ⅳ期患者17例。根據(jù)病理類型分為鱗癌患者29例，腺癌患者11例。低分化癌患者14例，中高分化癌患者26例。患者吸煙數(shù)量≥600支/年的患者23例，患者吸煙數(shù)量﹤600支/年的患者17例。本研究患者均無接受過任何藥物治療，在此抽取患者的外周血作為檢測標本進行檢測。

另外，在確定肺癌組患者的同時，選取20例肺部具有輕微病變（主要包括一些輕微的炎癥等病變，其中肺炎7例，慢性支氣管炎6例，結(jié)核性胸膜炎4例，膿胸、氣胸、肺結(jié)節(jié)病各1例）的患者作為肺部良性疾病組。該組患者中，有男性14例，女性6例，年齡18～75歲，平均年齡55歲，此組患者無癌變現(xiàn)象。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成總RNA提?。涸诨颊呖崭範顟B(tài)下抽取患者4 ml外周血，在抽取的新鮮外周血中加入EDTA-Na進行抗凝。采取密度梯度離心分離的方法將淋巴細胞分離出來。進而將分離好的分離液在無RNase的條件下采用Trizol試劑對其進一步地提取分離，最終提取的RNA為總RNA。采用紫外分光光度計檢測RNA中的R值，根據(jù)公式A260/A280計算出RNA的總濃度。采用Fermentas公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的合成要求對cDNA進行合成，并且將得到的總RNA與合成的cDNA在-20℃的冰箱中進行保存。

1.2.2實時熒光定量PCR反應根據(jù)上海生工生物工程有限公司設計及合成引物序列如下：β-actin F（5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'），β-actinR（5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'）；hTERT F（5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'），hTERTR （5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'）。熒光定量檢測：在10 μl的反應體系中進行反應；反應條件：在95℃的高溫條件下進行預變性30 s，該操作循環(huán)進行40次（95℃變性6 s、58℃退火15 s、74℃延伸25 s）；溶解條件：在95℃的高溫條件下進行溶解60 s、在58℃的高溫條件下進行高溫溶解25 s、在95℃的高溫條件下進行溶解30 s。

1.2.3熒光定量PCR產(chǎn)物鑒定步驟：hTERT PCR的產(chǎn)物取5 μl，6×loading Buffer混勻，將該產(chǎn)物加樣在2%瓊脂糖凝膠上進行混合，通100 V的恒壓進行電泳30 min，最后采用EB染色，取染色片在凝膠成像系統(tǒng)下攝片，觀察條帶。

1.3統(tǒng)計學處理

相對定量值計算公式：2-△△Ct?！鰿t為樣本和內(nèi)參△Ct均值，△△Ct=△Ct（-對照組Ct均值-改組內(nèi)參Ct均值）。本研究采用2-△△Ct表示cDNA中包含的所要檢測的基因含量。應用SPSS16-.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，兩組之間mRNA測定值的比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用Fisher’s Exact Test檢驗，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1hTERT mRNA實時熒光定量擴增曲線

肺癌患者外周血中hTERT mRNA（圖1），當Ct水平≤36時，其熒光定量的擴增曲線呈典型的S形曲線，溶解曲線也會呈現(xiàn)為單峰相。而肺部良性疾病組標本，Ct水平>36時也未見典型S形波形，即使擴增40個循環(huán)也沒有典型S形曲線出現(xiàn)，多為略有翹起的不規(guī)則波浪線。

圖1　部分患者標本的hTERT mRNA實時熒光定量擴增曲線

2.2hTERT熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

肺癌組患者hTERT mRNA的陽性表達率分別為58.2%，部分標本高表達hTERT mRNA，而肺部良性疾病組基本不表達hTERT mRNA，陽性表達率僅為5%，明顯低于肺癌組患者（P﹤0.001，圖2），所得的條帶大小和定量結(jié)果是基本一致的。

圖2　各組外周血hTERT擴增結(jié)果

2.3 hTERT mRNA在兩組患者外周血中的相對表達量

hTERT mRNA在兩組患者外周血中的相對表達量不同，在NSCLC患者中的表達量為（3.02± 0.12），而肺良性疾病患者表達量為（2.43±1.12），兩組的表達量差異具有顯著統(tǒng)計學意義（t=-4.562，P ﹤0.05）。

2.4外周血hTERT mRNA與臨床特征的關系

外周血hTERT mRNA的陽性例數(shù)與年齡、性別、吸煙與否、組織類型、分化層度無顯著差異，僅與臨床分期方面具有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表1）

3　討論

在肺癌治療過程中，常見的臨床問題是出現(xiàn)局部和遠處轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移是患者預后不良的主要原因。如果能在早期評估其預后狀況并采取相應的治療措施，那么肺癌的病死率可能會大大降低。Pellatt等[6]提出血循環(huán)中的生物標志物對腫瘤風險評估、治療效果和腫瘤復發(fā)均有監(jiān)測作用。研究人員正在試圖采取非侵入性方式從標本，如血漿、痰液中找到腫瘤標志物，以期在早期診斷和隨訪患者時，及時對腫瘤風險評估。檢測發(fā)現(xiàn)，患者的腫瘤組織中、血循環(huán)中均存在異常的DNA[7]。

癌癥的發(fā)展是一個復雜的過程，涉及基因和一些演變過程，其最終是由于細胞的再生與凋亡發(fā)生失調(diào)的結(jié)果。因此，維持正常的組織細胞處于平衡狀態(tài)，可以有效地減少癌癥的發(fā)生，端粒酶在維持細胞平衡方面起著重要的作用。對于健康人類，端粒酶活動只能在生殖細胞、造血細胞、激活淋巴細胞和其他潛在的增殖細胞中被發(fā)現(xiàn)[8]。但是在腫瘤細胞中可以發(fā)現(xiàn)大量的端粒酶[9]。此外，80%的NSCLC患者中可檢測到端粒酶活性[10]，且和TNM分期密切相關。病情進展較快的肺癌患者具有較高的端粒酶活性[10]。本實驗熒光定量PCR結(jié)果證明，hTERT mRNA在肺癌患者外周血中的表達率較高，并且癌癥的TNM分期與其表達層度具有顯著關系，但是hTERT mRNA的表達與患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤的組織學類型及分化程度方面無明顯相關性。綜上所述，端粒酶的激活是肺癌過程中的一個關鍵步驟，與肺癌TNM分期相關，因此可以作為早期肺癌患者的分子標志物，對腫瘤的早期診斷、風險評估提供幫助，但是其與腫瘤進展及預后的相關性仍需進一步探索。

表1　外周血hTERT mRNA與臨床特征的關系

[1]劉險峰,孫魯山,楊治國.hTERT mRNA聯(lián)合CYFRA21-l、NSE在肺癌檢測中的應用研究[J].醫(yī)學檢驗,2012,12 (23):123-126.

[2]何文武,黃國雄,胡松,等.非小細胞肺癌PITX1與hTERT mRNA表達相關性分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20 (13):757-759.

[3]丁明,仇鐵峰,李獻文,等.hTERT、Skp2、TTF-1mRNA聯(lián)合檢測在非小細胞型肺癌早期診斷中的意義[J].廣東醫(yī)學,2015,36(10):1523-1525.

[4]謝學成,邱海,湯帆,等.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國癌癥防治雜志,2014,6 (3):252-255.

[5]SiegelR,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013 [J].CACancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[6]Pellatt AJ,WolffRK,Herrick J,et al.TERT'sRole in colorectal carcinogenesis[J].Mol Carcinog,2013,52(7): 507-513.

[7]魏曉軍,白雪,聶玉輝,等.T7RNA聚合酶催化的熒光擴增技術(shù)檢測結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細胞hTERT與臨床病理的關系[J].臨床軍醫(yī)雜志,2012,40(4):846-848.

[8]劉少平,方春華,胡亞華,等.結(jié)直腸癌及癌前病變組織中hTERT表達及其臨床意義[J].臨床消化病雜志,2014,26 (2):83-86.

[9]閆洪生,侯英撲,丁玉珀,等.IGFBP-3基因mRNA表達水平在膠質(zhì)母細胞瘤患者預后評價中的意義[J].臨床腫瘤學雜志,2015,20(10):879-881.

[10]Yang CH,Yue J,Pfeffer SR,et al.MicroRNA-21 promotes glioblastoma tumorigenesis by down-regulating insulin-like growth factor-binding protein-3(IGFBP3)[J].J Biol Chem,2014,289(36):25079-25087.

TheRole of hTERT mRNAin lung cancer△

LI Xian-wen1QIU Tie-feng2#DING Ming3JIN Jian-hua11
Department of Medical Oncology,2Respiratory Medicine,Wujin Affiliated Hospital of Jiangsu University,Changzhou 213002,Jiangsu,China3Department ofRespiratory Medicine,Affiliated Hospital of Jiangsu University,Changzhou 212002,Jiangsu,China

ObjeccttiivveeTo investigate the diagnostic value of human telomeraseReverse transcriptase(hTERT)micrometastases in peripheral blood of patients with lung cancer.MeetthhooddThe peripheral blood sample of 40 cases of NSCLC lung cancer,and 20 cases of benign lung lesions were collected before startingRespective treatment,and theReal-time PCR method was applied to detect and evaluate the hTERT mRNA.Reessuulltt(1)TheRelative mRNA expression level of hTERT in NSCLC patients were significantly higher than those in benign lung disease patients(P<0.05).(2)The positiveRate of mRNA expression of hTERT in peripheral blood from 40 patients with NSCLC were 58.2%,while that of hTERT expression in peripheral blood from patients with benign lung disease were 5%,which was markedly lower compared with NSCLC patients(P<0.001).(3)For patients with NSCLC,the tumor TNM stage was significantly correlated with positiveRate of hTERT mRNA expression(P=0.004),whereas there were no correlations between the positiveRate of hTERT mRNA expression and age,gender,smoking,histopathlogical type and tumor cell differentiation degree.Coonncclluu--ssiioonnThe hTERT mRNAexpressions in peripheral blood could be used as a molecular marker for diagnosis of NSCLC.

R563

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.01.20

常州市科技計劃項目（CY2011901）#

（corresponding author），郵箱：qiutiefeng@163.com

2015-11-17）