劉軍彤，吳敬，陳晟

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 2141222 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

工業(yè)生物技術(shù)

分散泛菌蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達及發(fā)酵優(yōu)化

劉軍彤1，2，吳敬1，2，陳晟1，2

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122
2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

劉軍彤， 吳敬， 陳晟. 分散泛菌蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達及發(fā)酵優(yōu)化. 生物工程學(xué)報， 2016， 32（8）: 1070-1080.

Liu JT， Wu J， Chen S. Expression and production optimization of sucrose isomerase from Pantoea dispersa in Escherichia coli. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1070-1080.

為了提高分散泛菌Pantoea dispersa UQ68J來源的蔗糖異構(gòu)酶產(chǎn)量，研究了不同信號肽及發(fā)酵條件對蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達的影響。將攜帶天然信號肽的蔗糖異構(gòu)酶基因優(yōu)化后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21 （DE3） 構(gòu)建重組表達菌株——ORI菌株，搖瓶發(fā)酵總酶活和胞外酶活分別為85 U/mL、65 U/mL。從天然信號肽開始第22位氨基酸作為成熟蛋白的起始，連接PelB或OmpA信號肽構(gòu)建P22和O22菌株，其中P22菌株發(fā)酵總酶活提高至138 U/mL，是ORI菌株總酶活的1.6倍；而O22菌株發(fā)酵總酶活和ORI菌株無明顯差別。采用3.0 g/L的乳糖誘導(dǎo)，P22菌株的蔗糖異構(gòu)酶總酶活提高至168 U/mL。在3 L發(fā)酵罐中，研究甘氨酸濃度和誘導(dǎo)時間對蔗糖異構(gòu)酶分泌的影響，當(dāng)補加0.5%甘氨酸，DCW為18 g/L （OD600=30）開始誘導(dǎo)，P22菌株的蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活最高達1 981 U/mL，同時蔗糖異構(gòu)酶總酶活達到2 640 U/mL，是已報道大腸桿菌重組表達蔗糖異構(gòu)酶的最高水平。

蔗糖異構(gòu)酶，信號肽，發(fā)酵優(yōu)化

異麥芽酮糖 （6-O-a-D-吡喃葡糖基-D-果糖）是蔗糖的 1種同分異構(gòu)體，其很多物理性質(zhì)與蔗糖相似，如具有甜度、易溶于水等［1-2］。此外，異麥芽酮糖不易水解，被食用后，人體內(nèi)葡萄糖和胰島素濃度仍然維持在一定范圍內(nèi)，能夠有效預(yù)防糖尿病，因此被看作糖尿病患者的理想食品［3-4］。目前，異麥芽酮糖作為食品添加劑，已經(jīng)應(yīng)用于糕點、糖果、飲料等食品領(lǐng)域，且需求量不斷增加。然而，天然的異麥芽酮糖主要存在于蜂蜜、甘蔗汁中，其含量非常低，無法滿足市場需求。工業(yè)上異麥芽酮糖主要通過蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖來獲得［5］。

蔗糖異構(gòu)酶能催化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，并生成少量的葡萄糖和果糖［5-7］。據(jù)文獻報道，來源于大黃歐文氏菌 Erwinia rhapontici NCPPB1578［7］、大黃歐文氏菌E. rhapontici NX-5［8］、歐文氏桿菌屬Erwinia sp. D12［9］、克雷伯氏肺炎菌Klebsiella pneumonia NK33-98-8［10］、紅 色 精 朊 桿 菌Protaminobacter rubrum CBS574.77［11］、克雷伯氏桿菌屬 Klebsiella sp. LX3［12］、普城沙雷氏菌Serratia plymuthica ATCC15928［13］、P. dispersa UQ68J［14］等的蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)生的主產(chǎn)物為異麥芽酮糖，轉(zhuǎn)化率介于 65%-91%，其中來源于 P. dispersa UQ68J的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中表達，其純酶轉(zhuǎn)化率高達91.0%，是已報道的最高轉(zhuǎn)化率［15］。

此外，目前報道的采用野生菌生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶，大部分產(chǎn)量較低。因此，有人嘗試構(gòu)建重組菌株來表達蔗糖異構(gòu)酶，以提高蔗糖異構(gòu)酶的產(chǎn)量。目前，E. rhapontici NX-5［8］、Klebsiella sp. LX3［12］、P. rubrum CBS574.77［11］、E. rhapontici DSM 4484［16］、腸桿菌屬Enterobacter sp.FMB-1［17］、K. pneumonia NK33-98-8［10］、植生克雷伯氏菌 Klebsiella planticola UQ14S［14］來源的蔗糖異構(gòu)酶都已成功在大腸桿菌中重組表達。蔗糖異構(gòu)酶的表達量介于15-654 U/m L。程勝等采用高密度發(fā)酵，胞外蔗糖異構(gòu)酶酶活達到654 U/m L，是目前文獻報道最高的酶活［15，18］。此外，來源于Enterobacter sp. FMB-1的蔗糖異構(gòu)酶還在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae［19］和乳酸乳球菌Lactococcus lactis MG1363［20］中重組表達，但其表達量相對較低。

Wu 篩選獲得的P. dispersa UQ68J，該菌株生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶能夠高效合成異麥芽酮糖。但將去除信號肽 （1-33位氨基酸） 的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中克隆表達，可溶性蔗糖異構(gòu)酶的含量很低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)［14］。因此，本實驗以P. dispersa UQ68J來源的蔗糖異構(gòu)酶為研究對象，嘗試更換信號肽提高蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達量，同時采用高密度發(fā)酵實現(xiàn)蔗糖異構(gòu)酶的高產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1基因和菌株

根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性對來源于 P. dispersa UQ68J的蔗糖異構(gòu)酶完整基因 （NCBI Accession Number AY223549.1，包括信號肽和成熟肽） 進行基因優(yōu)化并合成 （Generay，上海）。將合成的基因與 pMD-18T連接，轉(zhuǎn)入 E. coli JM 109擴增重組質(zhì)粒，利用NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)核酸電泳和基因片段純化后，連接無信號肽的表達載體 pET-24a （+） 構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli JM 109進行擴增，基因測序正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主E. coli BL21 （DE3），獲得ORI菌株 （表2）。

表1　更換信號肽引物Table 1 Primers used in changing signal pep tides

表2　構(gòu)建的菌株及其特征Tab le 2 The recombinant stains and the property

1.1.2試劑

質(zhì)粒小提試劑盒 （天根生化科技有限公司）；蛋白電泳試劑和蛋白分子量標準 （南通碧云天技術(shù)研究所）；卡那霉素 （上海生工生物有限公司）；蛋白胨、酵母粉 （英國Oxoid公司）；異麥芽酮糖、海藻酮糖標樣 （Sigma公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，和NaCl 10.0。

TB培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨 12.0，酵母粉24.0，甘油 5.0，KH2PO4·3H2O 2.3，K2HPO416.4。

3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基 （g/L）：（NH4）2HPO44.0，KH2PO4·3H2O 13.5，檸檬酸·H2O 1.7，MgSO40.8，工業(yè)蛋白胨 1.0，工業(yè)酵母粉 2.0，甘油 8.0；并添加微量元素10 m L/L，用氨水調(diào)節(jié)pH至 7.0。

微量元素液 （g/L）：Al2（SO4）3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，H3BO30.5，MnSO4·H2O 14.6，Na2MoSO43.0，NiSO4·6H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 15.0。

補加培養(yǎng)基 （g/L）：甘油600.0，MgSO49.0，工業(yè)酵母粉4.8，工業(yè)蛋白胨 2.4。

誘導(dǎo)劑為20 g/L的乳糖。

1.1.4主要儀器

凝膠成像儀、蛋白電泳儀 （美國Bio-Rad公司）；Agilent 1 100 高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）；細胞破碎儀 （浙江寧波新芝生物科技股份有限公司）；3 L-Infors 全自動發(fā)酵罐 （伊孚森生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1信號肽的更換

PelB信號肽，其堿基序列為：5′-ATGAAAT ACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCT GCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC-3′。OmpA信號肽，其堿基序列為：5′-ATGAAAAA GACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGC TGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC-3′。PelB、OmpA信號肽前期已經(jīng)連接到表達載體pET-24a （+） 上，同時兩信號肽的堿基序列末端和pET-24a （+） 載體間插入了ATGG 4個堿基來添加Nco I限制性酶切位點。

根據(jù)蔗糖異構(gòu)酶基因序列，分別設(shè)計以22、34位點為起始氨基酸的上游引物F22和F34，及下游引物R22/34。

以P22重組菌株的構(gòu)建為例：設(shè)計引物F22 和R22/34，以優(yōu)化的蔗糖異構(gòu)酶基因作為模板，經(jīng)PCR獲得22位點為起始氨基酸的堿基序列，將其與 pMD18T-simple載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli JM 109進行擴增，經(jīng)Nco I和Xho I限制性內(nèi)切酶酶切，采用核酸電泳和基因片段純化獲得目的堿基序列，將純化后的目的序列與含有PelB信號肽的表達載體pET-24a （+） 連接，轉(zhuǎn)入E. coli JM 109擴增質(zhì)粒，基因測序正確后，轉(zhuǎn)入表達宿主E. coli BL21 （DE3） 中，即獲得表達菌株P(guān)22。按照同樣方法通過PCR擴增、限制性酶切等分子操作獲得起始氨基酸分別為 22 和34位點的兩個目的片段的堿基序列，將其分別與攜帶 PelB、OmpA信號肽的表達載體pET-24a （+） 連接。將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21 （DE3），則分別獲得P22、P34、O22、O34重組菌株。

1.2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將構(gòu)建好的重組菌株接種到LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體的抗性添加抗生素 （卡那霉素終濃度30 μg/m L，氨芐青霉素終濃度 100 μg/m L），37 ℃、200 r/m in培養(yǎng)8 h。將上述培養(yǎng)的表達菌株的種子培養(yǎng)液按 5%接種量，轉(zhuǎn)接到含有50 m L TB培養(yǎng)基的搖瓶中，并補加終濃度為30 μg/m L的卡那霉素。37 ℃培養(yǎng)至OD600=1.0，根據(jù)需要添加誘導(dǎo)劑IPTG （終濃度0.1 mmol/L）、乳糖 （終濃度1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L）誘導(dǎo)，或者不添加誘導(dǎo)劑，25 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。定時取樣，分別測定樣品的 OD600、DCW （細胞干重） 和蔗糖異構(gòu)酶的酶活。

1.2.3生物反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng)

在3 L發(fā)酵罐中，按照10%的接種量添加種子培養(yǎng)液到半合成培養(yǎng)基中，并補加終濃度為30 μg/m L的卡那霉素。37 ℃培養(yǎng)至DCW達到9 g/L （OD600=15） 時，補加不同濃度的甘氨酸。繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，直到DCW達到誘導(dǎo)所需的濃度時，降低溫度到30 ℃，并采用0.1 g/（L·h）的乳糖誘導(dǎo)。整個發(fā)酵過程中，通過儀器自動補加氨水維持pH 7.0；同時，通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速 （200-900 r/min） 和空氣的流速 （1.5-4.0 L/min）控制DO在30%。

1.2.4生物量測定

細胞生長通過測定發(fā)酵液在 OD600的吸光度進行實時監(jiān)控。DCW的測定：5 m L發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/m in離心15 m in。離心沉淀用去離子水清洗后，10 000 r/m in再次離心10 m in，離心沉淀在105 ℃條件下烘干至恒重。

1.2.5發(fā)酵液及細胞中蔗糖異構(gòu)酶的分布及SDS-PAGE電泳

發(fā)酵液經(jīng)過離心處理，獲得發(fā)酵上清和沉淀，發(fā)酵上清的酶活稱為胞外酶活。含有細胞的離心沉淀回收后，用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸 （pH 6.0） 清洗后懸浮，并用緩沖液稀釋至 OD600=5.0。吸取 1 m L懸浮液 （OD600=5.0）放置冰上預(yù)冷20 m in，超聲破碎處理。離心處理獲得胞內(nèi)上清和沉淀，胞內(nèi)上清的酶活稱為胞內(nèi)酶活；沉淀即為胞內(nèi)不溶物。

將上述處理獲得的發(fā)酵上清、胞內(nèi)上清取出20 μL，并加入5 μL的加樣緩沖液；胞內(nèi)不溶物加入20 μL的加樣緩沖液，煮沸處理。上述兩種上清處理樣品各加8 μL，胞內(nèi)不溶物處理樣品加2 μL，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 處理，并采用考馬斯亮藍R-250染料染色，獲得蛋白質(zhì)圖譜。

1.2.6酶活測定

發(fā)酵樣品采用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸 （pH 6.0） 適當(dāng)稀釋后，取100 μL稀釋后的樣品加入到900 μL含有蔗糖的上述緩沖液中，蔗糖終濃度為 200 g/L。迅速混勻后，30 ℃反應(yīng)15 m in，沸水煮沸使其失活。利用HPLC檢測，采用Syncronis Am ino Column （Thermo） 柱子，流動相為 78%的乙腈，經(jīng)示差檢測后，根據(jù)樣品峰面積，計算異麥芽酮糖的含量。

酶活單位定義：上述條件下，每分鐘釋放1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量，定義一個酶活力單位。

2　結(jié)果與討論

2.1帶有天然信號肽的蔗糖異構(gòu)酶基因在大腸桿菌中重組表達

將P. dispersa UQ68J來源的帶有天然信號肽的蔗糖異構(gòu)酶原始基因，在保證氨基酸不變的前提下，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)化。優(yōu)化后的基因與原始基因同源性為81.6%，共替換283個密碼子，其中包括58個在大腸桿菌中使用頻率低于10‰的稀有密碼子。

將優(yōu)化后的蔗糖異構(gòu)酶基因與無信號肽的表達載體pET-24a （+） 連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21 （DE3） 獲得ORI菌株。采用不添加IPTG或IPTG終濃度為0.1 mmol/L兩種方式進行表達，結(jié)果顯示不添加IPTG時蔗糖異構(gòu)酶的總酶活和胞外酶活分別達到 85 U/m L 和65 U/m L （圖1）；添加0.1 mmol/L的IPTG時，蔗糖異構(gòu)酶總酶活和胞外酶活分別降到10 U/m L和4 U/m L。將胞內(nèi)不溶物進行SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，無論是否添加IPTG，細胞內(nèi)均形成大量包涵體，這可能是由于蔗糖異構(gòu)酶表達量過大，在胞內(nèi)不能及時折疊從而形成錯誤構(gòu)象。因此，后續(xù)實驗選擇不添加IPTG。

本實驗中，攜帶自身信號肽的蔗糖異構(gòu)酶基因在大腸桿菌中表達的總酶活達到85 U/m L，遠遠高于文獻報道的不含信號肽的蔗糖異構(gòu)酶基因表達的總酶活 （大約20 U/m L）［14］。其中，蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活達到65 U/m L，占總酶活的76.5%，說明信號肽對總酶活的提高起到關(guān)鍵性作用，并可將重組酶成功分泌至胞外。這可能是由于蔗糖異構(gòu)酶攜帶信號肽后，信號肽能引導(dǎo)蔗糖異構(gòu)酶快速通過細胞內(nèi)膜進入周質(zhì)空間。由于天然蔗糖異構(gòu)酶是一種胞外酶，周質(zhì)環(huán)境可能更利于其正確折疊，最終使蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活和總酶活升高。

然而，ORI菌株在不添加IPTG時仍然形成大量包涵體，這可能是因為來源于P. dispersa的蔗糖異構(gòu)酶信號肽不是大腸桿菌常用信號肽，當(dāng)目的蛋白大量表達時，無法高效引導(dǎo)目的蛋白分泌到細胞外。因此，嘗試使用大腸桿菌常用信號肽，來研究不同信號肽對蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響。

2.2不同信號肽對蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響

在大腸桿菌中，OmpA、PelB信號肽經(jīng)常用于重組蛋白的胞外表達。其中，OmpA信號肽成功實現(xiàn)了 α-CGTase［21］、exoglucanase［22］和TEM-в-lactanase［23］等重組蛋白的胞外表達；PelB 信號肽對角質(zhì)酶［24］、Pectate lyase［25］和Protein A-PhoA fusion protein［26］等重組蛋白具有良好的分泌效果。因此，本實驗分別研究了OmpA、PelB信號肽對蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響。

更換信號肽涉及到蔗糖異構(gòu)酶成熟蛋白的起始位點，文獻中Wu預(yù)測認為該蔗糖異構(gòu)酶的成熟蛋白起點為34位點［14］。本研究采用不同的軟件重新預(yù)測成熟蛋白起點，其中 SignalP 4.1 Server和predisi預(yù)測認為22位點為成熟蛋白起點；SPEPLip和TatP 1.0 Server預(yù)測認為34位點為成熟蛋白起點。據(jù)文獻報道，信號肽切點需滿足-3，-1原則——即-1、-3位點的氨基酸（信號肽切點前第1和第3個氨基酸） 必須含有一個小的中性側(cè)鏈，而且信號肽的-1位點通常是A la，有利于被信號肽酶識別切割［27］。觀察蔗糖異構(gòu)酶的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，21、33位點的氨基酸都是A la；19和31位點氨基酸分別為Tyr、Pro，都是含有小的中性側(cè)鏈的氨基酸，符合-1、-3原則。由于兩個預(yù)測位點都具有信號肽切點的特征，因此本實驗將外源信號肽分別與以22、34位點為起始位點的氨基酸序列連接。

將以22、34位點為起始位點的氨基酸序列對應(yīng)的基因與分別攜帶OmpA、PelB信號肽的pET-24a（+） 表達載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21 （DE3），獲得不同的重組菌株O22、O34、P22、P34菌株，不添加IPTG培養(yǎng)24 h。其結(jié)果如圖1所示。

ORI、O22、O34、P22、P34菌株表達蔗糖異構(gòu)酶的總酶活分別達到85、88、53、138和92 U/m L。其中，OmpA、PelB信號肽與 22位點連接獲得O22、P22菌株表達的蔗糖異構(gòu)酶總酶活，均明顯高于O34、P34菌株的總酶活。說明22位點氨基酸更可能是蔗糖異構(gòu)酶成熟蛋白的起始位點。

圖1　不同菌株在無IPTG條件下培養(yǎng)24 h的發(fā)酵結(jié)果Fig. 1 The fermentation results of strains w ithout IPTG after 24 h of culture. DCW （A）， total sucrose isomerase activity （B） and extracellular sucrose isomerase activity （C）.

進一步分析信號肽對蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響。與PelB信號肽連接獲得P22菌株的總酶活最高達138 U/m L，是ORI和O22菌株總酶活的1.6倍。SDS-PAGE顯示，P22菌株幾乎不形成包涵體。P34、O22和O34菌株仍然形成大量的包涵體 （圖2）。綜上說明，采用PelB信號肽并與22位點氨基酸連接，能明顯提高蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌表達的總酶活。

2.3發(fā)酵條件對蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響

2.3.1不同濃度乳糖對蔗糖異構(gòu)酶的影響

上述研究表明，P22菌株其蔗糖異構(gòu)酶總酶活最高，可作為進一步發(fā)酵優(yōu)化研究的菌株。為在發(fā)酵罐中對產(chǎn)酶條件進行研究，首先在搖瓶中考察了不同濃度的乳糖誘導(dǎo)對蔗糖異構(gòu)酶的影響。

圖 2 各菌株發(fā)酵上清、胞內(nèi)上清及胞內(nèi)不溶物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant， intracellular supernatant and intracellular insoluble protein. （A） Fermentation supernatant. （B）Intracellular supernatant. （C） Intracellular insoluble protein. 1: ORI strain； 2: P22 strain； 3: P34 strain； 4: O22 strain； 5: O34 strain； 6: marker.

實驗中，添加一定量乳糖誘導(dǎo) （濃度低于4.0 g/L） 時，蔗糖異構(gòu)酶總酶活比不添加誘導(dǎo)劑的總酶活明顯提高。其中添加終濃度3.0 g/L的乳糖誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶總酶活最高，達到168 U/m L，比不添加乳糖提高約21.7% （圖3）。但其胞外酶活較低，僅為蔗糖異構(gòu)酶總酶活的35.7%。因此，如何促進蔗糖異構(gòu)酶分泌到發(fā)酵液中，對蔗糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

2.3.2甘氨酸濃度對蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響

甘氨酸，是一種空間結(jié)構(gòu)簡單的氨基酸。當(dāng)細胞壁上的氨基酸被甘氨酸替代，會引起細胞壁的結(jié)構(gòu)松散。這有利于合成蛋白分泌到發(fā)酵液中，但也降低了細胞壁對細胞的保護作用，對細胞生長產(chǎn)生不利影響，進而可能影響酶產(chǎn)量［28-29］。因此，尋找適宜的甘氨酸濃度，對提高蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活具有重要意義。

圖3　P22菌株在不同濃度乳糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)24 h的發(fā)酵結(jié)果Fig. 3 The fermentation results of P22 strain w ith different concentration of lactose after 24 h of culture. DCW （A）， total sucrose isomerase activity （B） and extracellular sucrose isomerase activity （C）.

圖4　甘氨酸濃度對蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活、總酶活和生物量 (DCW) 的影響Fig.4 The effect of different glycine concentrations on extracellular sucrose isomerase activity （A）， total sucrose isomerase activity （B） and biomass （C）.

在3 L罐中，補加不同濃度的甘氨酸 （0%、0.5%和1%） 時，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率隨甘氨酸濃度的增加而不斷提升，胞外酶活和總酶活分別達到586、1 148、566 U/m L和2 339、3 029、1 032 U/m L （圖4）。其中，補加甘氨酸濃度為0.5%時，蔗糖異構(gòu)酶的總酶活和胞外酶活最高，分別是不補加甘氨酸的2.0和1.3倍；同時，細胞生長也未受到影響，DCW達到83.5 g/L。當(dāng)補加甘氨酸濃度為1.0%時，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率最高 （54.8%）；但細胞生長受到明顯影響，DCW為62.2 g/L，是不補加甘氨酸時DCW的77.1%。因此，補加0.5%甘氨酸最適。

2.3.3誘導(dǎo)時間對蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響

補加甘氨酸能促進蔗糖異構(gòu)酶的分泌，但仍有大量的蔗糖異構(gòu)酶未能分泌到發(fā)酵液中，需要采用其他策略進一步提高分泌效率。文獻報道，重組蛋白的表達會對細胞生長產(chǎn)生代謝壓力，導(dǎo)致細胞生長速率、生物量及蛋白表達量降低［28］。為減輕這種不利影響，采用不同的誘導(dǎo)時間，發(fā)現(xiàn)重組酶的分泌效率不同。當(dāng)誘導(dǎo)時間提前，分泌效率逐漸提高，但對細胞的傷害愈加明顯［28-29］。因此，研究了不同誘導(dǎo)時間對蔗糖異構(gòu)酶分泌效率的影響，以獲得最佳誘導(dǎo)時間，來提高蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活。

圖5　誘導(dǎo)時間對蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活、總酶活和生物量 (DCW) 的影響Fig. 5 The effect of different induction time on extracellular sucrose isomerase activity （A）， total sucrose isomerase activity （B） and biomass （C）.

實驗中，分別采用DCW為30 g/L、18 g/L 及9 g/L （OD600=50、30及15） 時開始誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率隨誘導(dǎo)時間提前分泌效率不斷提升，胞外酶活和總酶活分別達到1 148、1 981、1 501 U/m L和3 029、2 654、1 742 U/m L（圖5）。當(dāng)DCW為30 g/L （OD600=50） 時開始誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶總酶活和生物量最高，但其胞外酶活僅占總酶活的37.9%。將誘導(dǎo)時間提前至DCW為18 g/L （OD600=30） 時，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率達到74.6%，胞外酶活達到最高 （1981 U/m L），是DCW為30 g/L （OD600=50） 開始誘導(dǎo)胞外酶活的1.7倍。當(dāng)DCW為9 g/L （OD600=15）誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶分泌效率最高 （86.2%），但其細胞生長受到嚴重抑制，DCW最低只有44.0 g/L，僅為DCW 為 30 g/L （OD600=50） 開始誘導(dǎo)生物量的52.7%。綜合比較，當(dāng)DCW為18 g/L （OD600=30）時，蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活最高。

通過實驗確定了最優(yōu)發(fā)酵條件為：補加0.5%甘氨酸，DCW為18 g/L （OD600=30） 時進行誘導(dǎo)。該條件下，蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活最高，達到1 981 U/m L，是不補加甘氨酸時胞外酶活（586 U/m L） 的2.4倍，也是目前蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中表達的最高胞外酶活。

3　結(jié)論

本文研究了不同信號肽及發(fā)酵條件，對P. dispersa蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達的影響。采用攜帶天然信號肽及基因優(yōu)化策略，蔗糖異構(gòu)酶的總酶活明顯升高。更換PelB信號肽并與22位點的氨基酸連接，使蔗糖異構(gòu)酶的總酶活進一步提升。3 L發(fā)酵罐中，采用最適的甘氨酸濃度和誘導(dǎo)時間，蔗糖異構(gòu)酶分泌效率得到大幅提高，胞外酶活最高達1 981 U/m L，總酶活達到2 640 U/m L，該研究為其他蔗糖異構(gòu)酶的高效生產(chǎn)提供參考。

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（本文責(zé)編 陳宏宇）

November 17， 2015； Accepted: January 19， 2016

Sheng Chen. Tel/Fax: +86-510-85326653； E-mail: chensheng@jiangnan.edu.cn

Expression and production optim ization of sucrose isomerase from Pantoea dispersa in Escherichia coli

Juntong Liu1,2, Jing Wu1,2, and Sheng Chen1,2

1 State Key Laboratory of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China
2 Key Laboratory of Industrial Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122，Jiangsu， China

To improve the yield of sucrose isomerase from Pantoea dispersa UQ68J， we studied the effect of different signal peptides and fermentation conditions on sucrose isomerase expression in Escherichia coli. The gene of sucrose isomerase was optim ized and expressed in E. coli BL21 （DE3） w ith native signal peptide which was named as ORI strain. The total and extracellular enzyme activity was 85 and 65 U/m L in the flask， respectively. The mature protein， which started from the 22th am ino acid， was connected w ith the PelB and OmpA signal peptide to construct P22 and O22 strain，respectively. The total activity of P22 reached 138 U/m L， which was 1.6 times of ORI strain. The total activity of O22 strain was sim ilar to that of ORI strain. Induced by 3.0 g/L lactose， the total activity of P22 strain increased to 168 U/m L. In 3 L fermentor， the effects of glycine concentration and induction time were studied. Induction when the DCW reached 18 g/L （OD600=30）， w ith 0.5% glycine， the extracellular enzyme activity reached 1 981 U/m L， and the total enzyme activity reached 2 640 U/m L， which is the highest activity of sucrose isomerase that was expressed in recombinant E. coli.

sucrose isomerase， signal peptides， fermentation optim ization

Supported by: National Science Fund for Distinguished Young Scholars （No. 31425020）， The Project of Outstanding Scientific and Technological Innovation Group of Jiangsu Province （Jing Wu， 111 Project） （No. 111-2-06）， Natural Science Foundation of Jiangsu Province （No. BK20140132）， The Fundamental Research Funds for the Central Universities （No. JUSRP51304A）.

國家杰出青年基金 （No. 31425020），江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊項目 （吳敬，111計劃） （No. 111-2-06），江蘇省自然科學(xué)基金 （No. BK20140132），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金 （No. JUSRP51304A） 資助。