唐霞光,張春妹,劉　嘉,肖培云,*,楊永壽

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理 671000)

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美洲大蠊不同提取物清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性研究

唐霞光1,張春妹1,劉嘉1,肖培云1,*,楊永壽2

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理 671000)

目的:研究美洲大蠊不同提取物ML-A,ML-A1,ML-A2,ML-A3,ML-A4,ML-A5,ML-A6,ML-A7清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性的作用。方法:采用DPPH法研究美洲大蠊不同提取物清除自由基的能力,用硫代巴比妥酸(TBARS)法研究美洲大蠊提取物對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的抑制作用,評(píng)價(jià)其抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。結(jié)果:美洲大蠊不同提取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用,能抑制肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。結(jié)論:ML-A2對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng),ML-A4對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用最強(qiáng)。

美洲大蠊提取物,氧自由基,脂質(zhì)過(guò)氧化,抗氧化

美洲大蠊,作為一種傳統(tǒng)中藥材,因其對(duì)多種疾病的治療作用而逐漸引起人們的關(guān)注。然而,美洲大蠊的食用價(jià)值至今開發(fā)較少,加之人們一直視蟑螂為害蟲,對(duì)食用昆蟲藥了解甚微,導(dǎo)致美洲大蠊多以可食用干燥蟲品及精粉在市場(chǎng)流通。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)蟑螂含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦質(zhì)元素和微量元素,具有很高的藥用、食用價(jià)值。隨著人們生活水平的提高,人們對(duì)健康問(wèn)題的關(guān)注更加密切,具有預(yù)防疾病及延緩衰老功能的保健品逐漸成為人們的首選。

自由基主要包括各種形式的活性氧,性質(zhì)活潑,氧化作用極強(qiáng)[1],能直接與細(xì)胞膜上的成分發(fā)生反應(yīng),引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化,使相應(yīng)蛋白質(zhì)和酶的活性發(fā)生改變,損傷線粒體,攻擊DNA,誘導(dǎo)基因突變[2],對(duì)人體產(chǎn)生很大的傷害。臨床上常見(jiàn)的免疫性損傷和炎性損傷等與氧自由基及其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)密切相關(guān)。藥用昆蟲美洲大蠊(Periplanetaamericana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲,俗稱“蟑螂”,其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3],研究表明,美洲大蠊不同提取物具有抗腫瘤、抗病毒、促進(jìn)組織修復(fù)等作用[4-6]。近年來(lái)隨著對(duì)美洲大蠊化學(xué)成分及藥理作用的深入研究,其藥用價(jià)值也受到廣泛的關(guān)注,以美洲大蠊為原料的抗乙肝病毒新藥“肝龍膠囊”及正在研發(fā)的抗衰老活性部位均有一定的體外抗氧化作用[7-8]。

DPPH法來(lái)評(píng)價(jià)外源抗氧化劑和植物抗氧化能力是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、直接可行的方法,抗氧化劑直接作用于DPPH自由基,與間接測(cè)定氧化產(chǎn)物的減少的方法相比,該法通過(guò)測(cè)定DPPH自由基吸收的變化即可評(píng)價(jià)藥物的抗氧化能力[9]。體內(nèi)抗氧化能力評(píng)價(jià)主要是借助氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的測(cè)定來(lái)判斷生物活性物質(zhì),其中對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)程度是常用評(píng)價(jià)方法之一,硫代巴比妥酸(TBARS)法就是一種被廣泛使用、非侵入性的體內(nèi)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化方法[10]。本研究從美洲大蠊中經(jīng)過(guò)分離純化得到不同的提取部位,采用 DPPH與TBARS法相結(jié)合,系統(tǒng)研究不同提取部位清除氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用效果,旨在為下一步的藥理活性研究和美洲大蠊資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

美洲大蠊不同溶劑提取物凍干粉;1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)東京化成工業(yè)株式會(huì)社;硫代巴比妥酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、維生素C均為分析純;水超純水;SD昆明大鼠,180～220 g,雄性,大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

UV2500型紫外分光光度計(jì)日本島津公司;GeneQuant 100型微量紫外分光光度計(jì)美國(guó)Ge公司;LC-4012型低速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1美洲大蠊不同提取物對(duì)DPPH的清除作用DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其無(wú)水乙醇溶液在517 nm處有最大吸收[11]。DPPH自由基與美洲大蠊不同提取物溶液反應(yīng)后,DPPH自由基的量會(huì)減少,在517 nm處的吸光度值會(huì)降低,通過(guò)計(jì)算反應(yīng)后DPPH自由基的清除率評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化能力[12]。參考文獻(xiàn)方法略作修改[7-8],實(shí)驗(yàn)分為空白管、對(duì)照管、藥物底管及藥物管,藥物底管和藥物管中分別精密加入美洲大蠊不同提取物溶液1 mL,空白管及藥物底管中精密加入2.0 mL無(wú)水乙醇,對(duì)照管及藥物管中精密加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基溶液(均在10 mL棕色量瓶中操作),密封,混勻,暗處放置30 min,用超純水定容至刻度,搖勻,于517 nm處測(cè)定吸光值,按下式計(jì)算自由基的清除率:

DPPH清除率:I(%)=[A對(duì)-(A藥物管-A藥物底管)]/A對(duì)×100

其中:A對(duì)為對(duì)照管的吸光度,A藥物管為加入藥物溶液的吸光度,A藥物底管為不加DPPH藥物溶液本底的吸光度。

1.2.2美洲大蠊提取物大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用將健康大鼠禁食12 h,麻醉后迅速取肝臟,剪去脂肪及筋膜組織,用預(yù)冷的生理鹽水洗凈,濾紙拭干,稱重后,剪碎。以生理鹽水為勻漿介質(zhì),肝臟與生理鹽水重量比為1∶9,用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制得10%大鼠肝勻漿,低溫離心(3000 r/min,10 min),取上清液于冰箱中冷凍備用。參照文獻(xiàn)方法略作修改[13],實(shí)驗(yàn)分空白管、對(duì)照管、藥物底管和藥物管。取10%肝組織勻漿上清液0.5 mL分別加入對(duì)照管和藥物管,空白管和藥物底管加0.5 mL生理鹽水。藥物管和藥物底管加入不同濃度的美洲大蠊提取物0.5 mL,空白管和對(duì)照管加入蒸餾水0.5 mL,搖勻,37 ℃恒溫水浴振蕩1 h,各管加入10%硫代巴比妥酸溶液(精密稱取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中,先用1 mol/L NaOH溶液溶解,再用10%三氯乙酸定容至刻度),80 ℃水浴15 min,冷卻,離心(3000 r/min,10 min),以空白管標(biāo)零,取上清液于532 nm處測(cè)定吸光度,平行操作三次,按下式計(jì)算抑制率:

抑制率:I(%)=[A對(duì)-(A藥物管-A藥物底管)]/A對(duì)×100

其中:A對(duì)為對(duì)照管的吸光度,A藥物管為加入藥物溶液的吸光度,A藥物底管為不加大鼠肝組織勻漿藥物溶液本底的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1維生素C對(duì)DPPH·的清除作用

維生素C具有很強(qiáng)的抗氧化活性,在天然產(chǎn)物抗氧化活性研究中維生素C常被用來(lái)作為評(píng)價(jià)抗氧化能力強(qiáng)弱的參照[14]。用1.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定維生素C對(duì)DPPH自由基的清除曲線,其結(jié)果如圖1,根據(jù)計(jì)算,IC50值為0.0106 mg/mL。

圖1　維生素C對(duì)DPPH自由基的清除曲線Fig.1　The clearance curve of VC on DPPH free radical

2.2美洲大蠊不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

如圖2為美洲大蠊不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除曲線,由圖可知,美洲大蠊不同提取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用,但強(qiáng)弱有所不同。隨著提取物濃度的升高,清除DPPH自由基的能力也增強(qiáng)。與其他提取物相比,ML-A與ML-A2對(duì)DPPH自由基的清除作用較強(qiáng),藥物濃度為1.0 mg/mL時(shí)清除率可以達(dá)到80%以上。根據(jù)計(jì)算,各提取物清除DPPH的IC50值分別為:ML-A,0.336 mg/mL;ML-A1,0.966 mg/mL;ML-A2,0.311 mg/mL;ML-A3,0.436 mg/mL;ML-A4,0.474 mg/mL;ML-A5,0.652 mg/mL;ML-A6,27.55 mg/mL;ML-A7,5.32 mg/mL。以IC50值評(píng)價(jià),可知ML-A2對(duì)DPPH的清除作用最強(qiáng)。

圖2　美洲大蠊不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除曲線Fig.2　The clearance curve of Periplaneta Americanadifferent extract on DPPH free radical

2.3維生素C對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

丙二醛(MDA)作為一種脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物,是反映細(xì)胞氧化損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)。用硫代巴比妥酸(TBA)法考察抗氧化劑對(duì)MDA的抑制作用,以此評(píng)價(jià)抗氧化劑抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性[13]。用1.2.2項(xiàng)下方法評(píng)價(jià)維生素C對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的抑制作用,結(jié)果如表1。三個(gè)質(zhì)量濃度的維生素C均可抑制肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化,其中當(dāng)VC反應(yīng)濃度為1.5 mg/mL時(shí),對(duì)MDA的抑制作用可以達(dá)到70%以上。

表1維生素C對(duì)肝組織勻漿自發(fā)性

Table 1The inhibition of VCon MDA

樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)抑制率(%)維生素C0.543.20±1.211.060.68±1.941.570.39±1.75

2.4美洲大蠊不同提取物對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

測(cè)定5.0、10.0、15.0 mg/mL三個(gè)劑量點(diǎn)時(shí)美洲大蠊不同提取物對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用,結(jié)果如表2。隨著藥物濃度增加,各提取物對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)藥物濃度為5.0 mg/mL時(shí),各提取物的抑制作用差異較大。其中,ML-A4抑制率最高(49.35%±1.50%),抑制作用最強(qiáng);ML-A6抑制率最低(4.69%±0.73%),抑制作用最弱。當(dāng)藥物濃度為10.0 mg/mL時(shí),除ML-A6(39.32%±5.34%)與ML-A7(44.98%±2.28%)兩者抑制作用較弱外,其它提取物抑制作用相當(dāng)。當(dāng)藥物濃度為10.0 mg/mL時(shí),ML-A與ML-A4抑制作用最強(qiáng),抑制率分別為72.65%±2.91%、72.33%±1.94%。綜上可知,ML-A4對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用最強(qiáng),抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性最高。

樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)抑制率(%)ML-A5.036.25±1.5510.051.29±4.5015.072.65±2.91ML-A15.037.06±2.7710.049.84±4.3715.066.34±2.96ML-A25.029.61±2.4310.049.84±4.3715.065.53±2.72ML-A35.026.54±1.0210.048.22±2.7215.062.62±3.01ML-A45.049.35±1.5010.060.84±2.9115.072.33±1.94ML-A55.032.20±3.6910.049.68±2.4315.066.02±0.97ML-A65.04.69±0.7310.039.32±5.3415.054.53±2.43ML-A75.08.74±3.2010.044.98±2.2815.058.58±2.96

綜上,美洲大蠊不同提取物、維生素C均有清除DPPH自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用,隨著質(zhì)量濃度的增加作用增強(qiáng)。美洲大蠊提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,但活性弱于維生素C。通過(guò)DPPH、TBA法這兩種方法檢測(cè)美洲大蠊不同提取物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)ML-A2對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng),IC50值為0.311 mg/mL;ML-A4對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用最強(qiáng),抑制率在70%以上。兩種方法測(cè)定結(jié)果有一定差異,原因可能是不同提取部位中組成成分及含量不同,適用方法不一樣。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊不同提取物均有清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用,其中ML-A2為清除DPPH自由基活性最強(qiáng)的部位,ML-A4為抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性最強(qiáng)的部位。研究結(jié)果說(shuō)明美洲大蠊在保健品開發(fā)方面具有很高的潛力,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)美洲大蠊不同提取物抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià),其抗氧化活性與治療疾病之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

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Research of the effect ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts on scavenging free radical and anti-lipid perxidation

TANG Xia-guang1,ZHANG Chun-mei1,LIU Jia1,XIAO Pei-yun1,*,YANG Yong-shou2

(1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali 671000,China;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali 671000,China)

Objective:To study the effect of scavenging free radical and anti-lipid perxidation onPeriplanetaAmericanadifferent extract(ML-A,ML-A1,ML-A2,ML-A3,ML-A4,ML-A5,ML-A6,ML-A7). Method:DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts. Using TBA to study the inhibition ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts on MDA in the rat liver tissue homogenate. Result:PeriplanetaAmericanadifferent extracts had certain scavenging effect on DPPH· and could inhibit MDA the rat liver tissue lipid oxidation products of spontaneous generation. Conclusion:During the different extracts ofPeriplanetaAmericana,ML-A2 had the strongest effect of scavenging DPPH·,ML-A4 had the strongest effect of anti-lipid perxidation.

PeriplanetaAmericanaextracts;Oxygen free radical;lipid perxidation;antioxidant

2015-11-16

唐霞光(1991-),女,碩士研究生,主要從事美洲大蠊抗肺纖維化研究,E-mail:874808019@qq.com。

肖培云(1970-),女,碩士,教授,主要從事昆蟲藥物研究開發(fā),E-mail:xpy990120@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360634,81560634);云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2015FA025)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0083-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.008