杜敬河,王　栩,朱永安,吳鳳英,段　杉,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2. 廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642;3.廣東永昊食品有限公司,廣東陽(yáng)江 529536)

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產(chǎn)甲殼素酶多粘類芽孢桿菌A1的篩選鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究

杜敬河1,2,王栩1,朱永安1,吳鳳英3,段杉1,2,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2. 廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642;3.廣東永昊食品有限公司,廣東陽(yáng)江 529536)

從土壤中分離得到一株產(chǎn)甲殼素酶的細(xì)菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定,確定為多粘類芽孢桿菌,命名為A1。研究發(fā)現(xiàn)甲殼素、殼聚糖和淀粉可誘導(dǎo)該菌產(chǎn)甲殼素酶;添加尿素可提高甲殼素酶產(chǎn)量。本文研究確定該菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件如下:培養(yǎng)基采用1%甲殼素(120目),0.05% MgSO4·7H2O,1.2%尿素,0.5% NaCl,0.07% K2HPO4,0.03% KH2PO4,0.3%酵母提取粉,初始pH4.5,接種齡12 h,接種量1%,于37 ℃培養(yǎng)78 h,在此條件下,該菌產(chǎn)甲殼素酶水平達(dá)到0.549 U/mL。該菌在對(duì)數(shù)期,其產(chǎn)酶曲線的上升略滯后于生長(zhǎng)曲線變化;而在衰亡期,產(chǎn)酶曲線的降低略早于生長(zhǎng)曲線的降低,說(shuō)明該酶的mRNA的穩(wěn)定性較差。

甲殼素酶,多粘類芽孢桿菌,發(fā)酵條件

甲殼素(chitin)又稱幾丁質(zhì),廣泛存在于蝦、蟹等甲殼類動(dòng)物以及低等生物菌類、藻類細(xì)胞中,是自然界中產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的第二大生物資源,它是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖單體(D-GlcNAc)通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子化合物[1-3]。甲殼素酶(chitinase E.C.3.2.1.14)又稱幾丁質(zhì)酶,可以降解甲殼素生成甲殼寡糖。甲殼寡糖是甲殼素糖鏈β-1,4糖苷鍵斷裂形成的寡聚體,具有抑菌、抗腫瘤、保濕、提高植物防御力等功能[4],已被廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域。

1961年,Euniauxc在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)甲殼素酶,目前已在細(xì)菌、真菌和植物中均發(fā)現(xiàn)甲殼素酶的存在。已報(bào)道產(chǎn)甲殼素酶的細(xì)菌主要有弧菌(Vibrio)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、假單胞菌(Pseudomonas)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)和芽孢桿菌(Bacillus)等[5-6]。多數(shù)微生物只有在含有甲殼素等誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中才能產(chǎn)生甲殼素酶,所產(chǎn)甲殼素酶多是分泌型的,即胞外酶[7]。

本文從土壤中篩選出一株產(chǎn)甲殼素酶的多粘類芽孢桿菌,并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

土壤樣品廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)湖邊、寧波海邊、陽(yáng)江海邊等地;甲殼素按照文獻(xiàn)[8]的條件制備甲殼素;ZR Fungal/Bacterial DNA KitTMZYMO RESEARCH;27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′通用引物廣州生工生物科技有限公司合成;DNA Marker DL2000NEW GENE BIOTECHNOLOGY;Goldview染料(含量95%)CAT;6×上樣緩沖液WOSLEN;2×Taq PCR Master MixDBI;其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

pHS-3CW酸度計(jì)上海般特儀器有限公司;LDZX-40B型立式自控電熱蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;EnSpire酶標(biāo)儀PerkinElmer公司;PCR儀Bio-Rad公司。

1.2培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基組成(w/v):1%膠體甲殼素,1%(NH4)2SO4,0.07% K2HPO4,0.03% KH2PO4,0.5% NaCl,0.05% MgS04·7H2O,0.3%酵母提取粉,1.5%瓊脂,pH為6.0。

膠體甲殼素的制備:稱取10 g甲殼素(100目),緩緩加入濃鹽酸200 mL,迅速攪拌,待其全部溶解后用玻璃棉過(guò)濾除去雜質(zhì),溶液加入1000 mL蒸餾水。離心得到沉淀,用蒸餾水洗至中性,冷凍干燥即得膠體甲殼素[9]。

復(fù)篩培養(yǎng)基組成(w/v):1%膠體甲殼素,1%(NH4)2SO4,0.07% K2HPO4,0.03% KH2PO4,0.5% NaCl,0.05% MgS04·7H2O,0.3%酵母提取粉,pH為6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成(w/v):1%甲殼素,0.05% MgS04·7H2O,1.2%尿素,0.5% NaCl,0.07% K2HPO4,0.03% KH2PO4,0.3%酵母提取粉,pH為4.5。

種子培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌株初篩將土壤用無(wú)菌水稀釋后,涂布于初篩培養(yǎng)基平板上,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。挑取菌落周圍有明顯透明圈的菌落,再采用平板劃線法分離純化。

1.3.2菌株復(fù)篩挑取初篩得到的菌落,接種到100 mL液體復(fù)篩培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫?fù)e床160 r/min培養(yǎng)72 h,測(cè)定發(fā)酵上清液中的甲殼素酶活力。

1.3.3甲殼素酶活力的測(cè)定參考韓寶芹[10]的測(cè)定方法,并改進(jìn)如下:將發(fā)酵液于4 ℃下10000 r/min離心5 min得上清液,取0.1 mL上清液(對(duì)照組中的酶液先在100 ℃煮沸5 min滅活),加入1.9 mL 1%膠體甲殼素(將膠體甲殼素溶于0.05 mol/L pH5.0 HAc-NaAc緩沖溶液中),混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h,再加入3 mL DNS溶液,沸水浴反應(yīng)5 min,冷卻后定容至25 mL,于520 nm處測(cè)定吸光值。酶活力單位(U)定義:上述條件下,1 mL酶液1 min轉(zhuǎn)化甲殼素產(chǎn)生1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位,同時(shí)以N-乙酰氨基葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4菌株鑒定

1.3.4.1形態(tài)學(xué)鑒定參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[11]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.3.4.216S rDNA鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建提取待鑒定菌株的DNA,采用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA[12]。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火45 s,72 ℃延伸l.5 min,30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR反應(yīng)液,在加Gold View的1%瓊脂糖凝膠電泳液中電泳30 min,用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往廣州生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之匹配的核苷酸序列。利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4.3生理生化鑒定細(xì)菌的生理生化鑒定參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[11]和文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行。

1.3.5發(fā)酵條件研究將5 mL種子液(培養(yǎng)24 h)接種于100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫?fù)e床160 r/min培養(yǎng)72 h。

不同碳源對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:在培養(yǎng)基中分別以1%蔗糖、1%葡萄糖、1% N-乙酰氨基葡萄糖、1%可溶性淀粉、1%甲殼素(120目)、1%殼聚糖和1%膠體甲殼素作為碳源,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

不同氮源對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:在培養(yǎng)基中分別以1%(NH4)2SO4、1% NaNO3、1% NH4NO2、1%牛肉膏、1%蛋白胨和1%尿素作為氮源,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

尿素濃度對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的尿素濃度,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：培養(yǎng)溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝有著重要的影響,在不同的培養(yǎng)溫度下微生物產(chǎn)酶種類和數(shù)量各不相同。分別在30、35、37、40、45 ℃條件下,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

培養(yǎng)基不同pH對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

種齡對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：在培養(yǎng)基中分別接種12、18、24、36、48 h不同種齡的菌液,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

表2　菌株A1生理生化特征

注:“+”.陽(yáng)性,“-”.陰性 。

表3　碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

注:“-”.未檢測(cè)到酶活力。

接種量對(duì)菌株A1發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：分別按1%、5%、10%、15%、20%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中的酶活力。

1.3.6菌株A1的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線測(cè)定在確定了發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件后,在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)菌株A1,每隔6～12 h取樣,采用比濁法于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定該菌發(fā)酵液的光密度,繪制生長(zhǎng)曲線;同時(shí)測(cè)定發(fā)酵上清液的甲殼素酶活力,繪制產(chǎn)酶曲線。

圖2　系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2　Phylogenetic tree of strain A1

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)甲殼素酶菌株的初篩

在以膠體甲殼素為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基上,發(fā)現(xiàn)5株產(chǎn)生透明圈的細(xì)菌,通過(guò)平板劃線法分離純化并進(jìn)行保存。

2.2產(chǎn)甲殼素酶菌株的復(fù)篩

表1為5株細(xì)菌發(fā)酵上清液中的甲殼素酶活力,發(fā)現(xiàn)其中A1的酶活力明顯高于其他菌株。因此,選擇A1菌株作為甲殼素酶的產(chǎn)生菌株。

2.3菌種鑒定

從圖1可以看出,菌株A1在初篩培養(yǎng)基上形成圓形、乳白色菌落,菌落稍凸起,濕潤(rùn)光滑,邊緣整齊,挑起有黏性。菌株A1經(jīng)革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)觀察為革蘭氏陰性菌。

圖1　菌株A1的菌落形態(tài)Fig.1　Colony morphology of strain Al

將菌株A1的16S rDNA序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),與多粘類芽孢桿菌相似度達(dá)到99%。MEGA 5.1軟件系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示,該菌株的遺傳進(jìn)化與多粘類芽孢桿菌最近,構(gòu)成一個(gè)分支(圖2)。

菌株A1生理生化特征如表2所示,與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第九版)芽孢桿菌目,類芽孢桿菌科,類芽孢桿菌屬,多粘類芽孢桿菌的描述相符。

結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果,將菌株A1鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。

2.4發(fā)酵條件

2.4.1碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響表3顯示,多粘類芽孢桿菌A1以粉末甲殼素作為碳源時(shí),甲殼素酶活力最高;其次是膠體甲殼素、殼聚糖和可溶性淀粉,分別為最高酶活力的53%、24%和17%。該菌以葡萄糖、蔗糖和N-乙酰氨基葡萄糖作為碳源時(shí)均可生長(zhǎng),但不能產(chǎn)生甲殼素酶,表明該菌所產(chǎn)甲殼素酶為誘導(dǎo)酶。

2.4.2氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響由圖3可知,氮源對(duì)多粘類芽孢桿菌A1產(chǎn)甲殼素酶影響很大,其中以尿素作為氮源時(shí)甲殼素酶最高,其次是硝酸鈉和硫酸銨。在以牛肉膏和蛋白胨作為氮源時(shí),該菌生長(zhǎng)繁殖速度快,但產(chǎn)甲殼素酶能力低。

圖3　氮源對(duì)多發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effects of various nitrogen sources on chitinase production

2.4.3尿素濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響從圖4可以看出,隨著培養(yǎng)基中尿素濃度的增加,多粘類芽孢桿菌A1產(chǎn)甲殼素酶能力先增高后降低;當(dāng)尿素濃度為1.2%時(shí),甲殼素酶活力達(dá)到最大值。

圖4　尿素濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effects of different concentrations of CO(NH2)2 on chitinase production

2.4.4培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響從圖5可以看出,培養(yǎng)溫度在35～40 ℃范圍內(nèi),多粘類芽孢桿菌A1產(chǎn)甲殼素酶較高;當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí),甲殼素酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)培養(yǎng)溫度高于40 ℃或低于35 ℃時(shí),甲殼素酶活力均會(huì)顯著降低。

圖5　溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of temperatures on chitinase production

2.4.5培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響從圖6可以看出,培養(yǎng)基初始pH在4.0～5.0之間變動(dòng)時(shí),pH對(duì)多粘類芽孢桿菌A1產(chǎn)甲殼素酶影響不大,都保持在較高水平;當(dāng)初始pH為4.5時(shí),甲殼素酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)初始pH大于5.0時(shí),隨著pH的增大,甲殼素酶活力逐漸降低。

圖6　培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of initial medium pH on chitinase production

2.4.6接種齡對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響從圖7可以看出,當(dāng)接種齡為12 h時(shí),多粘類芽孢桿菌A1產(chǎn)甲殼素酶活力最高;12 h后,隨著種齡時(shí)間的延長(zhǎng),甲殼素酶活力逐漸降低,在24 h后基本保持不變。12 h左右時(shí)該菌種處于對(duì)數(shù)期,此時(shí)細(xì)胞的生命力最強(qiáng),生長(zhǎng)至24 h左右時(shí)該菌種已進(jìn)入穩(wěn)定期,此時(shí)細(xì)胞的代謝活力開始減弱。

圖7　接種齡對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effect of inoculating age on chitinase production

2.4.7接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響從圖8可以看出,接種量對(duì)多粘類芽孢桿菌A1產(chǎn)甲殼素酶活力影響不大。當(dāng)接種量為1%時(shí),甲殼素酶活力最高;當(dāng)接種量為5%～20%時(shí),甲殼素酶活力隨接種量的增加而略有下降,推測(cè)這是因?yàn)檫^(guò)多的接種量導(dǎo)致裝液量增加,溶氧不足,細(xì)菌增殖緩慢,甲殼素酶活力降低。

圖8　接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.8　Effect of inoculum size on chitinase production

2.5菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線測(cè)定

從圖9可以看出,多粘類芽孢桿菌A1在12 h時(shí)開始迅速生長(zhǎng),進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;78 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,之后菌體密度不再隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;108 h后菌體密度開始降低,進(jìn)入衰亡期。12 h左右,甲殼素酶活力開始出現(xiàn),酶活力的最高峰幾乎與生長(zhǎng)曲線的最高峰同時(shí)出現(xiàn),在78 h時(shí)達(dá)到最大值0.549 U/mL;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),甲殼素酶活力不再上升;96 h時(shí),酶活力開始逐漸下降。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的關(guān)系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型:同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型。該菌在對(duì)數(shù)期,其產(chǎn)酶曲線的上升略滯后于生長(zhǎng)曲線變化;而在衰亡期,產(chǎn)酶曲線的降低略早于生長(zhǎng)曲線的降低,說(shuō)明甲殼素酶合成模式為中期合成型,該酶的mRNA的穩(wěn)定性較差[14]。

圖9　菌株A1生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線Fig.9　Time course of growth and enzyme production of strain A1

3　結(jié)論與討論

經(jīng)鑒定產(chǎn)甲殼素酶菌株A1為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)多粘類芽孢桿菌A1的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究,得到其產(chǎn)甲殼素酶的發(fā)酵條件為:1%甲殼素,0.05% MgSO4·7H2O,1.2%尿素,0.5% NaCl,0.07% K2HPO4,0.03% KH2PO4,0.3%酵母提取粉,培養(yǎng)基起始pH4.5,于37 ℃培養(yǎng)78 h。在此發(fā)酵條件下,該菌產(chǎn)甲殼素酶水平達(dá)到0.549 U/mL。該菌所產(chǎn)甲殼素酶為胞外酶,以甲殼素、殼聚糖和淀粉為底物可以誘導(dǎo)該菌產(chǎn)甲殼素酶;葡萄糖、蔗糖和N-乙酰氨基葡萄糖都不能誘導(dǎo)該菌產(chǎn)甲殼素酶。

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)是一類重要的植物生防細(xì)菌和根際促生菌。2002年,美國(guó)環(huán)保署(EPA)已將其列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物種類之一,對(duì)人和動(dòng)植物沒(méi)有致病性[15-16]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)多粘類芽孢桿菌的研究主要集中在:其對(duì)植物病害的防治、所產(chǎn)代謝活性物質(zhì)的種類及抗菌機(jī)理等方面[17-18],對(duì)其產(chǎn)甲殼素酶的相關(guān)研究未見報(bào)道。

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Screening of a strain of chitinase producingPaenibacilluspolymyxaA1 and investigation on its fermentation conditions for chitinase production

DU Jing-he1,2,WANG Xu1,ZHU Yong-an1,WU Feng-ying3,DUAN Shan1,2,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Engineering Research Center of Natural Active Substance,Guangzhou 510642,China;3.Guangdong Yonghao Foods Limited,Yangjiang 529536,China)

A strain of chitinase producing bacteria was isolated from soil,and was identified to bePaenibacilluspolymyxabased on its morphological,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing. The strain was named as A1. Chitin,chitosan and starch can induce A1 to produce chitinase. The adding of urea in medium improved the production of chitinase. The fermentation conditions for chitinase production were determined as follows:the fermentation medium consisting of 1% chitin(120 mesh),0.05% MgSO4·7H2O,1.2% CO(NH2)2,0.5% NaCl,0.03% KH2PO4,0.07% K2HPO4,0.3% yeast extract powder,pH4.5,starter culture age 12 h,inoculum size 1%,fermenting at 37 ℃ for 78 h. Under such conditions,the chitinase activity achieved 0.549 U/mL. At the exponential phase,the rising of chitinase production curve slightly lagged behind the growth curve of A1,at the decline phase,the falling of chitinase production curve was slightly earlier than the falling of growth curve. The results indicated that the mRNA of the chitinase was unstable.

Chitinase;Paenibacilluspolymyxa;fermention condition

2016-01-14

杜敬河(1991-),男,碩士研究生,研究方向:水產(chǎn)品加工與貯藏,E-mail:dujingheyouxiang@163.com 。

段杉(1966-),男,博士,副教授,研究方向:水產(chǎn)品綜合利用,E-mail:duanshan@scau.edu.cn。

廣東省省部產(chǎn)學(xué)研合作專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2013B090600111);廣東省教育廳科研項(xiàng)目(2013gjhz0003)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)13-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.023