孫顏君,孫顏杰

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室,光明乳業(yè)股份有限公司,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,上海 200436;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453000)

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紅曲霉在類Camembert干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

孫顏君1,孫顏杰2

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室,光明乳業(yè)股份有限公司,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,上海 200436;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453000)

從紅曲類食品中分離出一株高產(chǎn)色素,不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌種R-15,以紅曲霉R-15替代白霉用于類Camembert干酪生產(chǎn)。以傳統(tǒng)Camembert干酪為對照,研究紅曲霉R-15對類Camembert干酪成熟過程中(28 d)水分含量、pH、蛋白水解程度和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明,成熟過程中,對照和紅曲霉干酪表皮和中心的水分含量不斷降低,并在接近28 d時趨于穩(wěn)定;兩種干酪pH在干酪成熟過程中先降低后升高,且干酪表皮pH以及變化范圍都顯著大于中心部位(p<0.05);成熟后期,對照樣品的表皮和中心處pH4.6 酸可溶性氮含量分別顯著高于紅曲霉干酪(p<0.05),且成熟14～21 d期間,兩種干酪的12%三氯乙酸可溶性氮含量增加速率最快。紅曲霉干酪成熟過程中產(chǎn)生主要揮發(fā)性物質(zhì)共35種,包括酮類、醛類、酸類、醇類和酯類等,各類物質(zhì)的種類和含量都有別于對照樣品。

紅曲霉,類Camembert干酪,蛋白水解,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

Camembert干酪是世界上最著名的干酪之一,為一種軟質(zhì)的表面霉菌成熟干酪,起源于法國諾曼底。Camembert生產(chǎn)工藝包括原料乳殺菌、接種發(fā)酵、凝乳、切割、入模、排除乳清、鹽浸、接種霉菌發(fā)酵劑和成熟等工序[1]。卡門培爾干酪青霉(Penicillium)和白青霉(Pencilliumcandidum)是Camembert干酪中特有的霉菌,用于促進(jìn)干酪成熟,有助于干酪形成柔軟的質(zhì)地和特有的風(fēng)味[2]。由于飲食和消費(fèi)習(xí)慣差異,亞洲消費(fèi)者對于天然干酪,尤其是天然霉菌干酪的接受程度較低,市場容量較小。

關(guān)于Camembert干酪,國內(nèi)外已有大量的研究,主要集中于成熟過程中干酪的理化和風(fēng)味變化。關(guān)于Camembert干酪成熟用霉菌也有一定的研究,劉南[3]等從中國傳統(tǒng)食品——腐乳和臭豆腐中篩選出了六株霉菌,并確定了適合制作Camembert干酪的一株毛霉和帚狀地霉,這兩株霉菌混合成熟的干酪質(zhì)地柔軟,且比國外采用Penicillium和Pencilliumcandidum生產(chǎn)的干酪風(fēng)味更柔和,更能被中國人接受。

紅曲霉在中國已有上千年的應(yīng)用歷史,主要用于紅曲米(粉)、紅曲酒和醋等傳統(tǒng)食品,紅曲類產(chǎn)品因其天然紅色的色澤、特有的風(fēng)味廣受中國消費(fèi)者歡迎。近年來,紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物由于具有降低膽固醇、降血壓等功效而備受關(guān)注,主要次級代謝產(chǎn)物有莫納克林K,γ氨基丁酸等[4]。因此可考慮將紅曲霉替代其他霉菌用于Camembert干酪的生產(chǎn),制作出一款適合亞洲消費(fèi)者口味和具有中國特色的天然干酪產(chǎn)品。這不僅豐富了天然干酪的品類,且對于中國天然干酪的開發(fā)具有重要意義。目前尚未有任何關(guān)于紅曲霉應(yīng)用于天然干酪的研究。本實(shí)驗從中國傳統(tǒng)紅曲產(chǎn)品中篩選出一株高色素?zé)o桔霉素毒素的菌株,研究其在干酪成熟過程中對Camembert干酪理化和風(fēng)味的影響,為紅曲霉在天然干酪中的應(yīng)用研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮牛乳光明乳業(yè)華東中心工廠;紅曲米粉福建咕咕鮮食品有限公司;紅曲米浙江農(nóng)家采集;酵母粉葡萄糖氯霉素瓊脂(YGC)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)青島瑞水生物科技有限公司;Camembert專用乳酸發(fā)酵劑(MA14),Camembert專用霉菌發(fā)酵劑(PC12 和GEO17)和凝乳酶Marzyme 150丹尼斯克(中國)有限公司。

干酪槽,干酪切割刀和干酪模具APV中國有限公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Foss2300全自動凱氏分析定氮儀瑞典福斯分析儀器有限公司;奧林巴斯光學(xué)顯微鏡IX71日本奧林巴斯株會社;水分測定儀奧豪斯儀器(上海)有限公司;5975GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀美國安捷倫科技有限公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1桔霉素含量測定參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.222《紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定》[5]。

1.2.2色價的測定參考標(biāo)準(zhǔn)GB 4926-2008 《食品添加劑紅曲米(粉)中色價的測定方法》[6]。

1.2.3紅曲霉的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定從不同地域采集的紅曲產(chǎn)品中分離紅曲霉15株,在YGC培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)多次劃線分離,挑選早期菌落為白色,后期為紅色或者紫色的單菌落,編號分別為R1-R15,挑取單菌落于YGC平面培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d(30 ℃),觀察菌體生長狀態(tài),并在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。同時進(jìn)行YGC斜面培養(yǎng)紅曲霉菌株,30 ℃培養(yǎng)10 d,培養(yǎng)結(jié)束后在斜面上加入少量滅菌生理鹽水,并用玻璃珠進(jìn)行震蕩以洗脫孢子,取孢子懸浮液稀釋一定梯度后,吸取少量加入PDB培養(yǎng)基中,在30 ℃,180 r/min下培養(yǎng)10 d后取發(fā)酵液測定桔霉素和色素。

1.2.4菌株的鑒定采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法進(jìn)行回收產(chǎn)物純化后測序。根據(jù)楊成龍[7]已經(jīng)報道的紅曲霉特異性引物ITS 基因擴(kuò)增:ITS 序列采用通用引物 ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGC TTATTGATATGC)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增28S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)目的片段。ITS-PCR擴(kuò)增程序為:96 ℃預(yù)變性 1 min;96 ℃變性 30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共35 個循環(huán);72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物回收后測定,PCR產(chǎn)物測序委托生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2.5表面霉菌成熟干酪的制作

1.2.5.1霉菌孢子懸浮液的制備Penicillium和R15都于PDA斜面培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)7 d,直至孢子生成。用無菌水沖洗斜面,經(jīng)八層無菌紗布過濾,并利用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)為106/mL。

1.2.5.2干酪制作工藝傳統(tǒng)Camembert干酪制作參考Boutrou和Linton[8]等的方法,工藝流程如下:

新鮮牛奶→巴氏殺菌(72 ℃，15 s)→冷卻至32 ℃→接種發(fā)酵劑→待pH下降0.2后添加凝乳酶，凝乳30～40 min→切割排乳清→成型(15 ℃，相對濕度90%～95%過夜)→鹽漬→接種霉菌(孢子數(shù)為106/mL)→成熟28 d(15 ℃，相對濕度90%～95%)。

如上工藝得到的Camembert干酪作為對照樣品。紅曲霉干酪制作參考如上工藝并略加調(diào)整,其接種霉菌孢子數(shù)為106/mL的R15發(fā)酵液,并于25 ℃,相對濕度90%～95%條件下成熟28 d。

1.2.6干酪成熟過程中指標(biāo)的測定在Camembert干酪成熟過程中,霉菌只在干酪表面生長,因此干酪表面和內(nèi)部呈現(xiàn)不同的性質(zhì)。具體參考IDF NO 261[9]中干酪取樣方法(圖1),將一塊干酪根據(jù)成熟情況分為中心(A處)和表皮(B處)兩個部位,于A和B處分別取樣進(jìn)行分析。

圖1　干酪取樣示意圖Fig.1　Schematic of sampling the cheese

本研究中,白霉干酪的中心部位簡稱CC,邊緣部位CR;紅曲霉干酪的中心部位RC,邊緣部位RR。

1.2.6.1pH測定干酪的表皮和中心各取1 g樣品,將樣品與10 mL蒸餾水混合并用高速剪切機(jī)于12000 r/min下剪切1 min,成為干酪漿,測定干酪漿的pH。

1.2.6.2水分含量的測定采用水分測定儀進(jìn)行測試,干酪表皮和中心分別取樣3 g,置于干燥恒重的鋁箔盤上。測定溫度為180 ℃,讀數(shù)穩(wěn)定后,記錄樣品的水分含量,每個樣品測定三次并取平均值作為最終測定結(jié)果。

1.2.6.3pH4.6酸可溶性氮(pH4.6 acid-soluble nitrogen,pH4.6 ASN)的測定方法參考孫卓等的方法略加改進(jìn)[11]。準(zhǔn)確稱取1.5 g干酪,加入50 mL pH為4.6 的醋酸鹽緩沖液,采用高速剪切機(jī)在12000 r/min條件下剪切1 min,再用50 mL的緩沖液沖洗,懸浮液在4000 r/min的離心機(jī)中離心20 min。取上清液進(jìn)行凱氏微量定氮,并以占干酪總氮量的百分?jǐn)?shù)表示。進(jìn)行三次平行實(shí)驗,結(jié)果為平均值。

1.2.6.412%三氯乙酸溶液中可溶性氮(12% Trichloroacetic acid,12% TCA-SN)的測定方法參考孫卓等的方法略加改進(jìn)[11]。準(zhǔn)確稱取1.5 g干酪,加入25 mL 12%的TCA溶液,勻漿。再用25 mL的緩沖液充分沖洗,取上清液進(jìn)行微量凱氏定氮,并以占干酪總氮量的百分?jǐn)?shù)表示。進(jìn)行三次平行實(shí)驗,結(jié)果為平均值。

1.2.6.5干酪成熟期間風(fēng)味物質(zhì)的測定樣品處理:分別在干酪成熟期的1、7、14、21和28 d取樣,進(jìn)行冷凍干燥后與等量的無水Na2SO4混合碾碎至樣品混合物為粉狀,迅速將樣品裝入15 mL的樣品瓶內(nèi),制備后加蓋封口。將SPME 萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化2 h(溫度250 ℃),將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分,在60 ℃條件下超聲波萃取30 min,按以下條件進(jìn)行GC-MS 分析。

色譜條件:分離柱:OV1701,30 m×0.25 mm×0.25 μm;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:He;載氣流速:0.8 mL/min程序升溫:33 ℃,3 min;以10 ℃/min升至42 ℃;以5 ℃/min升至140 ℃;以18 ℃/min升至240 min,保持8 min。質(zhì)譜條件:離子源溫度:200 ℃;傳輸線溫度:250 ℃;檢測氣電壓:350 V;離子化模式:EI+;發(fā)射電流200 μA;電子能:70 eV;數(shù)據(jù)采集:全掃描。

數(shù)據(jù)分析:采用Agilent G1701 MSD Productivity Chemstation工作站進(jìn)行圖譜的定量分析。

1.3數(shù)據(jù)分析和處理

每組實(shí)驗重復(fù)測定3次,最后結(jié)果以均值+標(biāo)準(zhǔn)方差(mean±SD)表示。采用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗結(jié)果在p<0.05水平上的顯著性進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1紅曲發(fā)酵液中桔霉素和色價測定

紅曲米中分離出的15株紅曲霉菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的桔霉素和色價如表1。

表1　紅曲霉發(fā)酵液中桔霉素和色素含量

注:“-”表示含量過低或未檢出。

紅曲色素作為添加劑在各類食品中有著廣泛的應(yīng)用。近年來,紅曲色素廣泛應(yīng)用于發(fā)酵香腸中,用來替代亞硝酸鹽,提高了產(chǎn)品的安全性[12]。早在1931年,桔霉素已被證實(shí)可損害人體健康,其毒性可與黃曲霉毒素B1相提并論[13]。由表1可知,相同培養(yǎng)條件下,不同紅曲霉菌株的產(chǎn)色素和桔霉素能力不同。除菌株R-15外,其余菌株都產(chǎn)生桔霉素,R-13和R-8產(chǎn)桔霉素含量較高,分別為483 μg/L和247 μg/L。R-14產(chǎn)色素能力最好,R-13次之,兩者色價分別為5.75 U/mL和5.69 U/mL。對不同紅曲霉產(chǎn)桔霉素和色價含量進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明在0.05水平上差異顯著(p<0.05)。R-15用于干酪生產(chǎn),在28 d成熟周期中,并未有桔霉素檢出,因此R-15認(rèn)為是安全的,可用于干酪的成熟。

紅曲色素和桔霉素都屬于紅曲霉發(fā)酵后期產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,兩者的代謝途徑開始都由一個乙酰輔酶A的參與下合成戊酮,隨后分開為兩條途徑,一條由丁酮在丙二酰輔酶A的參與下合成戊酮,最后產(chǎn)生紅曲色素;另一條途徑由丁酮在乙酰輔酶A的參與下合成桔霉素中間體,最后產(chǎn)生桔霉素,因此紅曲色素產(chǎn)生常伴隨著桔霉素的產(chǎn)生[13]。

本研究中選用PDB培養(yǎng)基來研究紅曲霉產(chǎn)桔霉素情況,但僅用一種培養(yǎng)基不足以評價紅曲霉產(chǎn)毒素情況。不同的培養(yǎng)條件下,紅曲霉產(chǎn)生紅曲色素和桔霉素的能力也有差異。如改變培養(yǎng)基的氮源、加入短鏈酸[14]或改變培養(yǎng)過程的通風(fēng)量等[15]。為確保紅曲干酪產(chǎn)品的安全性,本研究中還主要跟蹤了紅曲霉在干酪成熟過程中產(chǎn)桔霉素情況,發(fā)現(xiàn)R-15在干酪成熟周期中并未有桔霉素產(chǎn)生。

2.2菌株鑒定

2.2.1菌種形態(tài)觀察R-15于YGC培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng),第5 d起該菌株開始產(chǎn)生色素物質(zhì),菌落中心的顏色由初期的白色慢慢向紅色轉(zhuǎn)變,菌落四周菌絲仍為白色。培養(yǎng)7 d后,菌落直徑約為22 mm(圖2中a)。菌落為圓形,平坦而稀疏,平板正面觀察菌落中間微隆起,邊緣整齊,有放射狀條紋,質(zhì)地致密,表面有絨毛狀菌絲;反面觀察菌落滲入周圍培養(yǎng)基中。

圖2　紅曲霉菌落(a)和孢子(b)顯微觀察圖Fig.2　Micro-morphology of Monascus colony(a)and spores(b)

顯微特征:由圖2中(b),分生孢子由菌絲生出,生在側(cè)?；蛘呔z頂端;分生孢子排列呈鏈狀,通常2～6個向基型生長,單個孢子呈圓形或者梨形;培養(yǎng)過程中有閉囊殼產(chǎn)生,呈橢球形,單生在類似柄菌絲上。根據(jù)R-15在培養(yǎng)基上的形態(tài)特征和孢子的顯微特征,并與紅曲霉屬的特征相對比,兩者基本吻合,初步判定R-15屬于紅曲霉屬的真菌。

2.2.2菌株生物學(xué)鑒定以R-15基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長度為544 bp的片段,與Genbank中其他紅曲霉菌株進(jìn)行比對和同源性分析,并篩選相似菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(圖3)。結(jié)果表明,該菌株與紅色紅曲霉(Monascusrubber)、紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)、叢毛紅曲霉(Monascuspilosus)都有較高的同源性。綜合形態(tài)特征和ITS序列分析,鑒定R-15為紫色紅曲霉。

圖3　基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on ITS sequences

2.3干酪成熟過程中指標(biāo)的測定

2.3.1水分含量測定結(jié)果成熟1～20 d期間,干酪表皮和中心的水分含量不斷降低,且在1～7 d下降速率最快(圖4)。成熟第7 d結(jié)束,CR,CC,RR和RC水分含量分別下降至57.24%,57.65%,56.49%和56.80%。隨后至21 d,水分含量進(jìn)一步下降,并在接近28 d時趨于穩(wěn)定,此時RR和RC的水分含量分別為52.33%和53.65%,均低于白霉干酪。整個成熟期間,兩種干酪的表皮水分含量顯著低于中心部位(p<0.05)。

圖4　干酪成熟期間水分含量的變化Fig.4　Change of water content during ripening period

干酪的水分含量不僅影響出品率,且對奶酪成熟過程中質(zhì)量的控制具有重要意義。 在1～7 d成熟期,干酪表面水分迅速蒸發(fā),導(dǎo)致表皮和中心水分含量大量下降,成熟7 d后霉菌逐漸覆蓋干酪表面,從而降低了表面水分蒸發(fā)率,但由于霉菌生長消耗水分,所以水分還會進(jìn)一步下降。在7 d以后成熟期中,白霉干酪表皮和中心水分含量都高于紅曲霉干酪,這可能是因為白霉生長情況優(yōu)于紅曲霉,能夠更好的覆蓋干酪表面,防止水分揮發(fā)。成熟20 d后,霉菌進(jìn)入緩慢生長期,且干酪表面開始形成一層薄殼,干酪的表皮和中心水分含量逐漸趨于穩(wěn)定。

2.3.2成熟過程干酪pH變化pH是影響干酪品質(zhì)的重要因素之一,pH與干酪成熟期間質(zhì)構(gòu)變化密切相關(guān)。圖5為干酪在28 d內(nèi)的pH變化情況。成熟1～7 d中,干酪表皮和中心的pH不斷下降,降低至4.2～4.3左右開始升高。兩種干酪的表皮pH變化范圍顯著大于中心部位,如整個成熟期間,CC的pH變化幅度為1.69,CR為1.29。在成熟終點(diǎn)處,RR的pH顯著高于RC、CC和 CR(p<0.05),而RC、CC和 CR之間pH差異不顯著(p>0.05)。

圖5　成熟過程中干酪表皮和中心pH變化Fig.5　pH change of cheese rind and core during the ripening period

霉菌干酪成熟過程中,pH呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。 霉菌干酪成熟初期,表皮和中心的乳酸菌優(yōu)先開始生長,不斷的消耗干酪中脂肪和乳糖,代謝產(chǎn)生乳酸鹽和脂肪酸,造成pH降低[16]。隨著成熟時間的增加,霉菌不斷在表面生長并產(chǎn)生蛋白水解酶,促進(jìn)蛋白水解并產(chǎn)生較多的NH4+,造成干酪表皮pH增加,干酪表面和內(nèi)部的pH形成梯度差,內(nèi)部乳酸向表皮擴(kuò)散,同時NH4+也會由表皮向中心滲透,內(nèi)部pH逐漸上升。P. camemberti菌絲生長和孢子萌發(fā)的過程中會消耗乳酸鹽,但乳酸菌生長過程中會產(chǎn)生乳酸鹽,因此干酪表面的乳酸鹽濃度會受到乳酸和霉菌孢子數(shù)的影響[17]。Leclercq P[2]研究Camembert干酪成熟發(fā)現(xiàn),成熟第6 d至終點(diǎn),干酪表面和中心的pH不斷上升,乳酸鹽濃度降低,生物胺的含量增加。

由于霉菌主要在干酪表面生長,因此干酪表面的pH變化較中心部位有更大的變化。表面霉菌成熟干酪中,pH的變化會影響干酪的質(zhì)構(gòu)和持水性,大量關(guān)于Camembert干酪研究已經(jīng)表明,pH升高有利于霉菌干酪形成較為柔軟的質(zhì)地。較高的pH條件下,磷酸鈣很快超出其溶解閾而在干酪表面析出,形成磷酸鈣濃度梯度,中心的可溶性磷酸鈣開始不斷向表皮擴(kuò)散并析出,從而在干酪表面形成一層較硬的外殼。而干酪內(nèi)部由于Ca2+濃度降低,質(zhì)地變得柔軟順滑。一些中性蛋白酶和脂肪酶的活性與pH密切相關(guān),因此pH的改變也會影響這些酶水解蛋白和脂肪的能力,從而影響干酪的風(fēng)味。由圖5可知,白霉干酪的中心和表皮pH都顯著高于紅曲霉干酪,這也可能是造成兩種干酪風(fēng)味存在差異性的原因之一。

2.3.3成熟過程干酪pH4.6 ASN值變化干酪成熟前,白霉和紅曲霉干酪的pH4.6 ASN值差異不顯著(p>0.05)。但是隨著成熟進(jìn)行,CR顯著高于RR(p<0.05),且成熟前7 d中,CR和RR的pH4.6 ASN增加速率較快,隨后趨于平緩。由圖5可知,RR的pH4.6 ASN在整個成熟周期中都高于RC;在成熟前期,CR比CC有較高的pH4.6 ASN值,但在成熟終點(diǎn)時兩者的pH4.6 ASN逐漸接近。

表面霉菌干酪中蛋白水解會受到不同種類的蛋白水解酶影響,包括發(fā)酵劑中微生物產(chǎn)生酶、凝乳酶、牛乳中纖溶酶,最重要的為成熟過程中霉菌產(chǎn)生的內(nèi)源和外源性蛋白酶。酪蛋白被蛋白酶水解后產(chǎn)生的肽可溶于pH4.6醋酸緩沖溶液,其他形式的氮溶解量非常少,因此可用pH4.6 ASN反映干酪成熟過程中酪蛋白水解情況[18]。CR和RR在前15 d成熟周期中pH4.6 ASN速率先增加后降低,表明此期間,主要是酪蛋白水解為長鏈肽。由于白霉和紅曲霉只在干酪表面生長,因此干酪內(nèi)部的酪蛋白水解速率處于緩慢增加狀態(tài),CC和RC直至成熟28 d后pH4.6 ASN速率才開始下降,且低于表面酪蛋白水解值。由圖5可知,白霉表面和中心的pH4.6 ASN分別高于紅曲霉干酪,這表明白霉比紅曲霉有更強(qiáng)的酪蛋白水解能力。

2.3.4成熟過程干酪12% TCA-SN值變化TCA-SN可反映干酪中酪蛋白水解產(chǎn)生的短肽和氨基酸氮的多少。白霉和紅曲霉干酪的表皮TCA-SN值在1～7 d成熟期內(nèi)迅速增加,中心部位TCA-SN變化較小;在14～21 d中,兩種干酪的表皮和中心TCA-SN增長速率達(dá)到最大值。由圖6可知,在前7 d成熟期中,兩種干酪的表皮和中心 TCA-SN程度相近,隨后白霉干酪TCA-SN值增加速率迅速升高,這表明白霉干酪中產(chǎn)生的肽酶和氨基酸酶的活力較紅曲霉強(qiáng)。成熟14 d后,CR的TCA-SN值大于RR;在21～28 d成熟期中,RR和RC的TCA-SN值差異逐漸減小。

圖6　成熟過程中干酪pH4.6可溶性氮含量變化Fig.6　pH4.6 acid-soluble nitrogen change of cheese during the ripening period

兩種干酪的表皮和中心在成熟7～14 d周期中TCA-SN有較快的增加速率,表明此階段酪蛋白水解產(chǎn)生的長鏈肽發(fā)生了近一步的水解,產(chǎn)生了短肽和氨基酸等。劉楠[3]采用毛霉和帚狀地霉制作干酪,發(fā)現(xiàn)在0～20 d期間TCA-SN增加較為平穩(wěn),20～30 d期間增加速率最大,且在25～30 d期間增加速率大于pH4.6-SN,說明在成熟后期主要產(chǎn)生了短肽和小肽。酪蛋白降解產(chǎn)生的長鏈肽中,有部分疏水肽會產(chǎn)生苦味,從而對干酪風(fēng)味產(chǎn)生不良影響,因此應(yīng)避免這些長鏈肽在干酪中過高的積累,加速長鏈肽分解為相應(yīng)的短肽和氨基酸的過程,以提高和改善干酪的風(fēng)味[19]。

綜上,penicillium比monascus有更強(qiáng)的蛋白水解能力,因此白霉干酪比紅曲霉干酪有較高的TCA-SN值。霉菌產(chǎn)生的蛋白水解酶只在產(chǎn)生部位發(fā)生催化作用,而不會進(jìn)行遷移,因此霉菌干酪中心部位的酪蛋白水解程度和水解速率通常較低,但肽酶等產(chǎn)生的小肽和氨基酸類卻可以由干酪的表面向中心遷移,從而提高中心的TCA-SN值,這是紅曲霉干酪成熟終點(diǎn)中心和表面TCA-SN逐漸接近的原因。

圖7　成熟過程中干酪12%三氯乙酸可溶性氮含量變化Fig.7　12% trichloroacetic acid nitrogen change of cheese during the ripening period

2.3.5成熟過程中干酪中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果紅曲霉干酪在成熟過程中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共35種,其中有酮類5種、醛類3種、酸類12種、醇類3種、酯類4種、內(nèi)酯類3種,硫化物、雜環(huán)和烷烴類各一種。

關(guān)于白霉干酪成熟過程中風(fēng)味的研究,已有大量文獻(xiàn)報道。表2為1～4周成熟期中,紅曲霉干酪各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分所占比例。酸類物質(zhì)在4周內(nèi)占揮發(fā)性物質(zhì)比例分別為79.62%,97.84%,93.24%和90.99%,在成熟2周時達(dá)到最大值。在4周成熟過程中,酮類物質(zhì)含量先降低后增加,主要為2-辛酮。紅曲霉干酪成熟初期,酯類物質(zhì)占揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比例為16.338%,成熟4周后降低至1.565%。內(nèi)酯類在整個成熟期內(nèi)占比約為0.5%～2.08%,主要包括γ-十一內(nèi)酯,δ-癸內(nèi)酯和δ-戊內(nèi)酯三種,這些內(nèi)酯類在Camembert成熟期間對其風(fēng)味有主要貢獻(xiàn),主要為水果香味,如桃子和杏的香味。在干酪成熟初期產(chǎn)生醛類物質(zhì),主要為苯乙醛、戊醛和十六醛三種,其中苯乙醛具有苦杏仁香味。紅曲霉干酪中硫化物產(chǎn)生量較小,僅在成熟后期檢出,約占所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比重的0.165%。酸類物質(zhì)主要為肉豆蔻酸和棕櫚酸,由于長鏈脂肪酸(>C12)的閾值較高,因此兩者對于干酪的主題風(fēng)味并沒有主要影響。

表2　紅曲霉干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量

注:“-”表示含量過低或未檢出。

對比文獻(xiàn)中白霉干酪揮發(fā)性風(fēng)味分析結(jié)果[20],主要是酮類、酯類和硫化物種類不同于紅曲霉干酪。白霉成熟干酪如Camembert和布里干酪成熟一周后產(chǎn)生甲基酮。此外,Penicillium可通過β-氧化長鏈脂肪酸,產(chǎn)生2-壬酮和2-庚酮,2-庚酮會產(chǎn)生類似于藍(lán)紋干酪的風(fēng)味,2-壬酮具有水果香氣,且白霉干酪成熟過程中產(chǎn)生的3-甲基-2-戊酮可賦予產(chǎn)品天然發(fā)酵的醇香;白霉干酪成熟過程中產(chǎn)生很多酯類物質(zhì),表征為水果和植物芳香,其中乙酸苯乙酯和丙酸苯乙酯對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。硫化物呈現(xiàn)大蒜的辛香味道,在Camembert干酪中,棒狀桿菌被認(rèn)為是產(chǎn)生硫化物的主要來源。硫化物含量的差異是紅曲霉干酪風(fēng)味較Camembert干酪風(fēng)味柔和的主要原因。

3　結(jié)論

3.1紅曲霉干酪成熟過程中并未檢測到桔霉素含量,因此R-15可用于干酪的生產(chǎn)。

3.2紅曲霉和Camembert干酪成熟過程中,由于蒸發(fā)作用,水分含量不斷降低;白霉干酪蛋白水解速率較快,且蛋白水解率較高,這導(dǎo)致在成熟周期中兩種干酪呈現(xiàn)出不同的pH、pH4.6 ASN和TCA-SN值。與白霉干酪相比,紅曲霉干酪成熟過程中,產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中主要酮類、酯類和硫化物種類不同于白霉干酪,其中硫化物產(chǎn)量低于白霉干酪。

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Application ofMonascusin the production of camembert imitation

SUN Yan-jun1,SUN Yan-jie2

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Bright Dairy and Food Co.,Ltd.,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Shanghai 200436,China;2. San Quan College of XinXiang Medical University,Xinxiang 453000,China)

MonascusR-15 with high yield of red pigment and low content of citrinin was selected from monascus products. The objective of this study was to evaluate the effect of R-15 on the proteolysis and volatile of camembert imitation during the ripening period(28 days). The moisture content of all the cheeses decreased and came to a stable value at the end of ripening time. pH increased at the beginning of the ripening period and then decreased. Moreover,pH of the rind part was significantly higher than the core of the cheeses(p<0.05);As the ripening period was prolonged,camembert presented the higher value of pH4.6 ASN thanmonascuscheese;During the ripening period of 14～21 days,TCA-SN increased rapidly;About 35 kinds of volatile substances(including ketones,aldehydes,acids,alcohols and esters ect.)were produced by the monascus cheese and were quite different from the camembert.

Monascus;camembert imitation;proteolysis;volatile

2015-12-08

孫顏君(1988-)，女，碩士，研究方向：乳品科學(xué)與加工，E-mail:15921569362@163.com。

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2013BAD18B02)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.025