王景富,王靜霞,3,左　旭,黃艷菲,滕　云,張紹山,劉　圓

(1.西南民族大學化學與環(huán)境保護工程學院,四川成都 610041;2.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院,四川成都 610041;3.四川工商職業(yè)技術學院酒類與食品工程系,四川都江堰 611830;4.湖北中醫(yī)藥大學教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室,湖北武漢 430065)

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基于黃酮類成分聚類分析的苦蕎粉摻兌檢測方法研究

王景富1,王靜霞1,3,左旭1,黃艷菲2,4,滕云1,張紹山1,劉圓2,*

(1.西南民族大學化學與環(huán)境保護工程學院,四川成都 610041;2.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院,四川成都 610041;3.四川工商職業(yè)技術學院酒類與食品工程系,四川都江堰 611830;4.湖北中醫(yī)藥大學教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室,湖北武漢 430065)

采用超高效液相色譜法建立苦蕎粉的色譜指紋圖譜。以蘆丁為參照峰,根據(jù)共有特征峰的相對峰面積,應用系統(tǒng)聚類分析法,對模擬分別摻入不含黃酮類的大麥粉和小麥粉的苦蕎粉進行指紋圖譜分析,區(qū)分和鑒別摻兌苦蕎粉。結果表明:當摻兌量達到2%時,摻兌不含黃酮類的大麥粉和小麥粉的苦蕎粉均可以與純苦蕎粉明顯地區(qū)分開;且市場購買的苦蕎粉與純苦蕎粉通過聚類分析法也能將兩者明顯區(qū)分。該方法操作簡便、靈敏度高,穩(wěn)定性、重復性好,可用于摻入不含黃酮類的大麥、小麥等樣品的快速鑒別。

苦蕎粉,摻兌檢測,聚類分析,超高效液相色譜法

苦蕎Fagopyrumtataricum(L.)Gaench,為蓼科Polygonaceae蕎麥屬Fagopyrum植物[1],為藥食同源植物。作為食物,苦蕎營養(yǎng)豐富,富含蛋白質、脂肪、多糖、維生素、微量元素和多種氨基酸等;作為藥物,苦蕎具有降糖降脂、抗疲勞、抗衰老及防治高血壓、冠心病的作用[2-5]。

由于苦蕎的食用價值、營養(yǎng)價值和藥用價值都較高,深受消費者的青睞,市場需求量大,但是常常發(fā)現(xiàn)商家為了牟取利益,以假亂真,用偽劣品以次充好,所以商品苦蕎粉的純度和質量已經(jīng)讓民眾不放心。HPLC(高效液相色譜)技術在食品類的成分檢測、食品添加劑的檢測及食品摻假檢測中已得到廣泛應用[6-8],超高效液相色譜(UPLC)技術是在HPLC的技術上進一步的發(fā)展,具有超高的分離度、分析速度及靈敏度的特點,在食品安全、藥物分析、環(huán)境分析等領域都有不斷的應用與發(fā)展。因此,本課題擬對苦蕎粉摻兌情況,采用超高效液相色譜法(UPLC)建立苦蕎粉以及摻兌苦蕎粉的UPLC指紋圖譜[9-11],計算所測樣品的指紋圖譜與對照品指紋圖譜的相似度,明確不同來源的苦蕎粉樣品間是否具有相同的超高效液相指紋特征。應用系統(tǒng)聚類分析法[12],對模擬摻入大麥粉與小麥粉的苦蕎粉摻兌樣品進行指紋分析,以此對純苦蕎粉和摻兌苦蕎粉樣品進行鑒別,以期對苦蕎及其部分苦蕎食品的質量評價和摻兌情況提供實驗數(shù)據(jù)和科學參考,為苦蕎安全、可靠、高效的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

苦蕎樣品22批不同農(nóng)業(yè)栽培品種均采自成都大學苦蕎實驗田,經(jīng)西南民族大學民族醫(yī)藥研究院劉圓教授鑒定為蓼科蕎麥屬植物苦蕎Fagopyrumtataricum(L.)Gaench的種子;大麥粉南陽興農(nóng)種業(yè)有限公司;小麥粉武威市西部糧油土產(chǎn)經(jīng)銷有限責任公司;苦蕎粉Z1成都人民營養(yǎng)食品廠;苦蕎粉Z2三綠有機食品有限公司;苦蕎粉Z3天津市港保稅區(qū)愛信食品有限公司;苦蕎粉Z4涼山州跨克苦蕎食品有限責任公司;苦蕎粉Z5山西雁門清高食業(yè)有限責任公司;蘆丁對照品(批號:MUST-12040302)和山奈酚對照品(批號:MUST-11041101)四川省成都市曼斯特生物科技有限公司;槲皮素對照品(批號:100081-200907)中國食品藥品檢定研究院;色譜甲醇美國Fisher Scientific公司;甲醇分析純;磷酸(色譜純)科密歐試劑公司;蒸餾水香港屈臣氏公司。

Waters Acquity UPLC H-Class System型超高效液相色譜儀,包括Acquity UPLC QSM,Acquity UPLC Sample Manager FTN,Acquity UPLC PDA Detector(美國Waters公司),工作站為Empower 3;Milli-Q美國Millipore公司;METTLER AE240電子分析天平梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;W210B恒溫水浴鍋上海申順生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1對照品溶液的制備分別精密稱取對照品蘆丁10 mg、槲皮素1 mg和山柰酚1 mg,于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配成濃度分別為1,0.1和0.1 mg/mL的對照品貯備液。

1.2.2供試品溶液的制備自采的苦蕎種子用打粉機打粉,過藥典5號篩;購買的商品苦蕎粉直接稱取,分別精密稱取各樣品0.2 g,置于具塞錐形瓶中,加入70%甲醇(v/v)20 mL,在室溫條件下超聲(250 W,40 kHz)30 min,靜置5 min后,過濾,取續(xù)濾液,將濾液離心15 min取上清液為供試品溶液,進樣前用0.22 μm有機濾膜過濾。

1.2.3色譜條件色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm);流動相組成:甲醇-0.1%磷酸水線性梯度洗脫;流速:0.2 mL/min;檢測波長:280 nm;進樣量:0.8 μL;柱溫:30 ℃;洗脫程序見下表:

表1　梯度洗脫程序

1.2.4方法學考察

1.2.4.1重復性實驗精密稱取苦蕎粉樣品西蕎1號5份,按照“1.2.2”項方法制備供試品溶液并進行測定,以蘆丁的相對保留時間和相對峰面積為參照,計算各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準差(RSD)均小于4%,說明該方法的重復性良好。

1.2.4.2精密度實驗精密吸取“1.2.4.1”項的苦蕎粉樣品西蕎1號供試品溶液,連續(xù)進樣5次,以蘆丁的相對保留時間和相對峰面積為參照,計算各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.7%,說明該儀器精密度良好。

1.2.4.3穩(wěn)定性實驗精密吸取“1.2.4.1”項的苦蕎粉樣品西蕎1號供試品溶液分別于0、4、8、16、32 h進行測定,以蘆丁的相對保留時間和相對峰面積為參照標準,各個共有峰的相對保留時間和相對保留峰面積的RSD均小于3%,說明該供試液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2　結果與討論

2.1苦蕎粉UPLC指紋圖譜的構建

2.1.1苦蕎粉UPLC指紋圖譜的建立對22批次苦蕎粉按照“1.2.2”項下方法制備供試液,按照“1.2.3” 項下方法進行UPLC分析,采集UPLC色譜圖,混合對照品見圖1,峰1、2、3分別依次對應的標準品為蘆丁、槲皮素、山奈酚。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A版),采用自動匹配方式生成了22批苦蕎粉樣品的指紋圖譜(S1～S22),用中位數(shù)法生成22批苦蕎粉樣品的對照指紋圖譜(R),得到22批苦蕎粉的指紋圖譜的7個共有峰,見圖2,其中3號、5號峰對應混合對照品的峰是蘆丁、槲皮素。

圖1　混合對照品的UPLC色譜圖Fig.1　UPLC chromatograms of hybrid reference substance注：1.蘆??；2.槲皮素；3.山奈酚。

圖2　22批次純苦蕎粉的指紋圖譜以及生成的共有模式Fig.2　UPLC fingerprints of 22 batches of Buckwheat 注:3.蘆丁，5.槲皮素，圖4、圖6、圖9同。

2.1.2苦蕎粉UPLC指紋圖譜的相似度分析指紋圖譜相似度是中藥質量控制的一個重要參數(shù),中藥指紋圖譜相似度常用于中藥的真?zhèn)舞b別研究和質量控制。本實驗利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)對所測樣品之間的指紋圖譜進行評價,以22批純苦蕎粉樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)生成對照指紋圖譜,并以此對各批次樣品的指紋圖譜的相似度進行評價。其結果(表2)表明:樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度都大于0.954,即22批純苦蕎粉樣品具有相似的UPLC 指紋特征。

2.2純苦蕎粉與摻兌大麥、小麥粉后的指紋圖譜比較分析

2.2.1摻兌大麥粉后的指紋圖譜比較分析對摻兌大麥粉的樣品及純苦蕎粉樣品采用“1.2.2”項下的方法制備供試液及“1.2.3”項下的色譜條件進行測定,采集UPLC指紋圖譜進行指紋圖譜分析,圖3為大麥粉UPLC色譜圖,摻兌大麥粉樣品與純苦蕎粉的指紋圖譜見圖4,S1～S7為純苦蕎粉,S8～S13為摻兌大麥的苦蕎粉,在大約14 min處,摻兌苦蕎粉都出現(xiàn)了純苦蕎粉不具有的峰,可以以此峰作為苦蕎粉是否摻兌大麥粉的鑒別依據(jù)。

圖3　大麥粉UPLC色譜圖Fig.3　UPLC chromatograms of barley powder

圖4　7個不同種的純苦蕎粉與摻兌大麥粉的指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig.4　UPLC fingerprints of the pure buckwheat powder and the buckwheat powder mixing barley

2.2.2摻兌小麥粉后的指紋圖譜比較分析對摻兌小麥粉的樣品及純苦蕎粉樣品采用“1.2.2”項下的方法制備供試液及“1.2.3”項下的色譜條件進行測定,采集UPLC指紋圖譜進行指紋圖譜分析,圖5為小麥粉UPLC色譜圖,摻兌小麥粉樣品與純苦蕎粉的指紋圖譜見圖6,S1～S7為7個不同農(nóng)業(yè)栽培品種的純苦蕎粉,S8～S13為摻兌小麥的苦蕎粉,在大約14 min處,摻兌苦蕎粉都出現(xiàn)了純苦蕎粉不具有的峰,可以以此峰作為苦蕎粉是否摻兌小麥粉的鑒別依據(jù)。

圖5　小麥UPLC圖譜Fig.5　UPLC chromatograms of wheat powder

圖6　7個不同種的純苦蕎粉與摻兌小麥粉的指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig.6　UPLC fingerprints of the pure buckwheat powder and the buckwheat powder mixing wheat

表2　22批次的苦蕎粉的指紋圖譜相似度

2.3系統(tǒng)聚類分析

2.3.1摻入大麥粉的摻兌苦蕎粉的鑒別因大麥粉中不含有蘆丁等黃酮類物質,故擬在純苦蕎粉中摻入大麥粉,苦蕎粉中的黃酮類成分含量會降低。因此本實驗模擬制備6個摻兌2%、5%、10%、15%、20%、25%的大麥粉的苦蕎粉樣品(A1～A6)。按照“1.2.2” 項下的方法制備供試液,并按照“1.2.3”項下的色譜條件進行測定。以3號峰(蘆丁峰)為參照峰的7個共有峰的相對峰面積組成的矩陣采用DPS軟件以規(guī)格化轉換-蘭氏距離-可變平均法對數(shù)據(jù)進行標準化統(tǒng)計分析,所得的聚類分析樹狀圖見圖7。

圖7　純苦蕎粉與摻兌大麥粉的聚類分析樹狀圖Fig.7　Hierachical clustering analysis of the pure buckwheat and the buckwheat powder mixing barley

從圖7上可知:西蕎2號、黔苦5號、野咸3號、川蕎1號、云南旱苦、川蕎2號可劃分為一類,這一類皆是純苦蕎粉;A1、A2、A3、A4、A5、A6可劃分為一大類,這一類皆為摻兌大麥粉的苦蕎粉。由此,當摻兌量達到2%時摻兌大麥粉的苦蕎粉與純苦蕎粉被明顯地區(qū)分開。

2.3.2摻入小麥粉的摻兌苦蕎粉的鑒別因小麥粉中不含有蘆丁等黃酮類物質,故擬在純苦蕎粉中摻入小麥粉,苦蕎粉中的黃酮類成分含量會降低。因此本實驗模擬制備6個摻兌2%、5%、10%、15%、20%、25%的小麥粉的苦蕎粉樣品(B1～B6)。按照“1.2.2” 項下的方法制備供試液,并按照“1.2.3”項下的色譜條件進行測定。以3號峰(蘆丁峰)為參照峰的7個共有峰的相對峰面積組成的矩陣采用DPS軟件以規(guī)格化轉換-蘭氏距離-可變平均法對數(shù)據(jù)進行標準化統(tǒng)計分析,所得的聚類分析樹狀圖見圖8。

圖8　純苦蕎粉與摻兌小麥粉的聚類分析樹狀圖Fig.8　Hierachical clustering analysis of the purebuckwheat and the buckwheat powder mixing wheat

從圖8上可知:西蕎1號、西蕎2號、黔苦5號、野咸3號、川蕎1號、云南旱苦、川蕎2號可劃分為一類,這一類皆是純苦蕎粉;B1、B2、B3、B4、B5、B6可劃分為一大類,這一類皆為摻兌小麥粉的苦蕎粉。由此,當摻兌量達到2%時摻兌小麥粉的苦蕎粉與純苦蕎粉明顯地區(qū)分開。

2.4純苦蕎粉與商品苦蕎粉的質量評價研究

2.4.1待測樣品的制備及檢測分析取適量的純苦蕎粉與商品苦蕎粉按照“1.2.2” 項下的方法制備供試液,并按照“1.2.3”項下的色譜條件進行測定,采集純苦蕎粉與商品苦蕎粉的UPLC色譜圖,按照“2.3”項下的方法對檢測數(shù)據(jù)進行聚類分析。

2.4.2純苦蕎粉與商品苦蕎粉的UPLC指紋圖譜比較分析該指紋圖譜以S1號樣品峰為參照峰,采用多點對照、自動匹配的方式生成對照指紋圖譜。由圖9可知,S1～S6為純苦蕎粉,S7～S11為商品苦蕎粉,在約12.8 min處,商品苦蕎粉與純苦蕎粉的出峰情況明顯不同,純苦蕎粉有明顯的峰出現(xiàn),而商品苦蕎粉沒有峰出現(xiàn),可以以此峰作為苦蕎質量評價的一個標準。

2.4.3純苦蕎粉與商品苦蕎粉的鑒別采用DPS2000聚類分析軟件,以不轉換數(shù)據(jù)轉換方式,絕對值聚類距離,平均法聚類方法進行聚類分析。從聚類分析圖10上可知:西蕎2號、黔苦5號、野咸3號、川蕎1號、云南旱苦、川蕎2號可被劃分為一類,Z1、Z2、Z3、Z4、Z5被劃分為一類,這兩大類能明顯地區(qū)分開。

圖10　純苦蕎粉與商品苦蕎粉的聚類分析樹狀圖Fig.10　Hierachical clustering analysis of the buckwheatpowder from the market and the pure buckwheat powder

3　結論

建立了苦蕎粉的UPLC指紋圖譜,測定結果表明22批樣品的指紋圖譜與對照品指紋圖譜的相似度均大于0.954,說明不同品種的苦蕎粉樣品間具有相似的UPLC指紋特征。應用系統(tǒng)聚類分析(HCA)法,對模擬摻入大麥粉與小麥粉的苦蕎粉摻兌樣品進行指紋分析,實驗結果表明:摻入質量分數(shù)2%及以上大麥粉或小麥粉的摻兌苦蕎粉樣品可予以鑒別。從大麥、小麥摻兌的指紋圖譜與純苦蕎粉的指紋圖譜上可以直觀地看出兩者有明顯的區(qū)別,而通過聚類分析也得出同樣的結論。通過對純苦蕎粉與商品苦蕎粉的比較分析可以發(fā)現(xiàn),在指紋圖譜中可以清楚的觀察到在12.8 min處商品苦蕎粉與純苦蕎粉的出峰情況明顯不同,純苦蕎粉有明顯的峰出現(xiàn),而商品苦蕎粉沒有峰出現(xiàn),以此峰可作為苦蕎粉質量評價的一個標準;再通過聚類分析發(fā)現(xiàn)西蕎2號、黔苦5號、野咸3號、川蕎1號、云南旱苦、川蕎2號6個純苦蕎粉可被劃分為一類,Z1、Z2、Z3、Z4、Z5等5個商品苦蕎粉被劃分為一類,這兩大類能明顯地區(qū)分開,說明純苦蕎粉與商品苦蕎粉在成分含量或者是黃酮類成分的含量上可能存在差異。該方法操作簡便、靈敏度高且穩(wěn)定性好、重復性好,可用于摻入大麥、小麥等樣品的鑒別檢測。

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Adulteration detection of buckwheat powder by clustering analysis of flavonoid components

WANG Jing-fu1,WANG Jing-xia1,3,ZUO Xu1,HUANG Yan-fei2,4,TENG Yun1,ZHANG Shao-shan1,LIU Yuan2,*

(1.School of Chemistry and Environmental Protection Engineering,Chengdu 610041,China;2.Ethnic Medicine Institute,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;3.Department of Alcohol And Food Engineering,Sichuan Technology And Business College,Dujiangyan 611830,China;4.Key laboratory of Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription,Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

In order to establish a detection method of buckwheat powder adulteration,chromatographic fingerprint of Ultra High Performance Liquid Chromatography(UPLC)method was used. Rutin as reference peak,according to relative peak area of the characteristic peak,simulated buckwheat powder samples adulterated respectively with barley powder or wheat flour were identified by System Clustering Analysis method. The results showed that buckwheat powder,which was adulterated with more than 2% barley powder or wheat flour,could be identified. The buckwheat powder from the market and the pure buckwheat powder could be clearly distinguished by clustering analysis method. The method was simple,high sensitivity and good stability,good repeatability,detection could be used to incorporate the identification of flavonoid-free barley,wheat and other samples.

buckwheat powder;adulteration detection;clustering analysis;ultra performance liquid chromatography

2015-12-08

王景富(1986-)，男，在讀碩士研究生，從事民族藥物學研究，E-mail：xnmdwjf@139.com。

劉圓(1968-)，女，博士，教授，從事民族藥物學研究，E-mail：yuanliu163@aliyun.com。

國家十三五科技支撐計劃(2015BAC05B02)；四川省科技計劃項目(2015SZ0062)。

TS207.3

B

1002-0306(2016)13-0309-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.055