楊　航，劉紅昌，石小兵，葛　菲，趙　致*，羅　輝

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省林業(yè)廳推廣總站，貴州 貴陽 550001)

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三葉木通果實轉(zhuǎn)錄組測序初步分析

楊航1，劉紅昌2，石小兵1，葛菲1，趙致2*，羅輝3

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省林業(yè)廳推廣總站，貴州 貴陽 550001)

為了探究三葉木通果實成熟過程中基因表達情況，本實驗采用Illumina HiSeq2000高通量測序技術(shù)對三葉木通6個不同時期果實進行了轉(zhuǎn)錄組測序，對所獲得的數(shù)據(jù)進行GO和KOG注釋與分類及KEGG代謝通路分析。本實驗共獲得Unigene 106 547 條，在GO與KOG數(shù)據(jù)庫中分別有27 302和12 014條Unigene注釋成功，KEGG通路分析顯示有11 749個Unigene參與到270 條已知代謝通路中，其中包括26條乙烯合成關(guān)鍵酶的Unigene。本實驗結(jié)果可為探究三葉木通果實成熟過程中基因表達情況以及三葉木通果實成熟基因的后續(xù)研究提供重要基礎(chǔ)。

三葉木通；果實；轉(zhuǎn)錄組

三葉木通(Akebiatrifoliate(Thunb.) Koidz)為木通科木通屬木質(zhì)藤本植物,原產(chǎn)于中國和日本，在我國主要分布于貴州、湖南、湖北、陜西、江西等地區(qū)[1]。三葉木通的近成熟果實可制作中藥預(yù)知子[2]，中藥預(yù)知子的藥效高低與三葉木通果實發(fā)育相關(guān)，果實發(fā)育過程即是藥效成分積累過程。α-常春藤皂苷是其主要指標(biāo)性成分和活性成分[3]，研究表明預(yù)知子中的有效成分對肝癌細胞的惡性增殖有抑制作用[4-5]。三葉木通果皮中含有黃酮類物質(zhì)[6]，莖中含有酚醇類物質(zhì)、三萜及三萜皂苷類物質(zhì)以及多種微量元素[7-8]。近年來，針對三葉木通的研究主要集中在對其生態(tài)學(xué)、藥理作用、扦插栽培、化學(xué)成分以及指紋圖譜等方面[9]，而基因表達方面的研究卻很少見。本實驗旨在為三葉木通果實基因克隆、表達分析乃至轉(zhuǎn)基因等研究提參考。

1　材料與方法

1.1材料

本實驗材料為野生三葉木通果實，取自貴州省貴陽市花溪區(qū)花溪鄉(xiāng)麥乃寨，經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙財副教授鑒定為木通科木通屬三葉木通Akebiatrifoliate(Thunb.) Koidz。采樣時間為自2014年4月起每隔一個月采樣一次，共采集6個時期的果實樣品。將果實采下后立即用液氮速凍，后轉(zhuǎn)存于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2RNA提取

果實樣品在冷凍的研缽和研杵中手工細磨，RNA提取利用OMEGA公司生產(chǎn)的Plant RNA Kit (200) R6827-02試劑盒。

1.3轉(zhuǎn)錄組測序

測序工作委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4數(shù)據(jù)拼接

Trinity軟件拼接得到轉(zhuǎn)錄本。取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。

1.5基因注釋

將Unigene比對到Nr (NCBI蛋白序列數(shù)據(jù)庫)、Nt (NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫)、PFAM(蛋白結(jié)構(gòu)域注釋分類系統(tǒng))、Swiss-Prot (蛋白序列數(shù)據(jù)庫)、GO (基因功能描述分類系統(tǒng))、KO (KEGG注釋系統(tǒng))、KOG (NCBI基因直系同源關(guān)系數(shù)據(jù)庫)7個數(shù)據(jù)庫中，進行功能注釋和分類以及KEGG代謝通路分析。

2　結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測序分為左端測序(L)和右端測序(R)，樣品的Raw reads數(shù)及Clean reads數(shù)均為左端測序與右端測序之和。Q20與Q30分別表示Phred 數(shù)值大于20和30的堿基占總體堿基的百分比，Phred 數(shù)值是在堿基識別過程中通過一種預(yù)測堿基判別發(fā)生錯誤概率模型計算得到的，一般以Q20 (對應(yīng)堿基正確識別率99%)來衡量數(shù)據(jù)質(zhì)量。結(jié)果顯示左端測序和右端測序結(jié)果及各樣品間GC含量基本一致，Phred 數(shù)值大于20的堿基占總體堿基百分比均在94%以上，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好(見表1)。

表1　測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2結(jié)果組裝

利用Trinity軟件對Clean Reads進行拼接，共獲得轉(zhuǎn)錄本193 578 條，平均長度為971 bp，N50與N90 (將拼接轉(zhuǎn)錄本按照長度從長到短排序，依次累加堿基數(shù)，當(dāng)累計堿基數(shù)達到轉(zhuǎn)錄本總堿基數(shù)的50%/90%時轉(zhuǎn)錄本的長度為N50/N90)分別為1 681bp和379bp。取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，共獲得106 547條Unigene，平均長度686 bp，N50與N90分別為1 088 bp和275 bp。總的來說，轉(zhuǎn)錄本與Unigene長度分布表現(xiàn)為長度短的轉(zhuǎn)錄本及Unigene數(shù)量多(表2)。

表2　拼接結(jié)果統(tǒng)計

2.3Unigenes功能注釋

將所得Unigene在7個數(shù)據(jù)庫中進行注釋，每個數(shù)據(jù)庫中分別注釋成功的Unigene條數(shù)及其占總Unigene數(shù)的百分比如表3所示。結(jié)果顯示，在Nr數(shù)據(jù)庫中注釋成功的Unigene最多(34 245條)，在KO數(shù)據(jù)庫中注釋成功的Unigene最少(9 852條)，在7個數(shù)據(jù)庫中至少一個數(shù)據(jù)庫注釋成功的Unigene有39 501條，占總Unigene數(shù)的37.07%。

表3　Unigene功能注釋

2.4GO分類

GO功能一般分為三個大類，即生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能。本試驗GO分析共有27 302 條Unigene注釋成功，且較多的單條Unigene能夠與多種基因相對應(yīng)[10]，其中注釋到生物學(xué)過程的Unigene最多(71 428條)；其次是注釋到細胞組分的Unigene有50 004 條；注釋到分子功能的Unigene最少(33 250條)。在三大類之下又分為55 個亞類以說明基因功能，其中細胞過程匹配Unigene最多(16 538條)，其次是代謝過程和結(jié)合功能分別有15 518 條和15 200條Unigene與其匹配(圖1)。

1：生物附著；2：生物調(diào)節(jié)；3：細胞損傷；4：細胞組成的組織和生物合成；5：細胞過程；6：發(fā)育過程；7：局部構(gòu)建；8：生長；9：免疫系統(tǒng)過程；10：定位；11：移動；12：代謝過程；13：多細胞生物過程；14：多生物過程；15：負調(diào)控過程；16： 正調(diào)控過程；17：生物過程管理；18：繁殖；19：生殖過程；20：刺激應(yīng)答；21：律動過程；22：信號；23：單菌種處理；24：細胞；25：細胞連接；26：細胞組分；27：細胞外基質(zhì)；28：細胞外基質(zhì)成分；29：胞外區(qū)；30：胞外區(qū)成分；31：大分子復(fù)合物；32：膜；33：膜封閉腔；34：膜組分；35：擬核；36：細胞器；37：細胞器組分；38：共質(zhì)體；39：突觸；40：突觸組分；41：病毒；42：病毒組分；43：抗氧化劑活動；44：結(jié)合功能；45：催化活性；46：通道調(diào)控；47：酶調(diào)控；48: 金屬伴侶活動；49：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)；50：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性；51：蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的活性；52：分泌活動；53：受體調(diào)控；54：結(jié)構(gòu)分子活性；55：轉(zhuǎn)運活性

圖1Unigene GO注釋和分類

Fig.1GO annotation and classification ofunigenes

2.5KOG分類

將12 014 條Unigene分類到26個Group (圖2)，其中一般功能預(yù)測注釋成功的Unigene最多(2 116 條)；其次是翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白注釋成功1 634 條；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源注釋成功1 020 條。仍有501條未知功能的Unigene等待進一步研究。

A：RNA 加工和修飾；B：染色體結(jié)構(gòu)和動力學(xué)；C：能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；D：細胞周期調(diào)控、細胞分裂、染色體分離；E：氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝；F：核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝；G：碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝；H：輔酶轉(zhuǎn)運和代謝；I：脂類轉(zhuǎn)運和代謝；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制重組與修復(fù)；M：胞壁/膜生物發(fā)生；N：細胞運動；O：蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運，分子伴侶；P：無機離子轉(zhuǎn)運和代謝；Q：次生產(chǎn)物生物合成，運輸及代謝；R：一般功能基因；S：未知功能；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；U：胞內(nèi)分泌秘膜泡運輸；V：防御機制；W：胞外結(jié)構(gòu)；X：未命名蛋白；Y：核酸結(jié)構(gòu)；Z：細胞骨架

圖2Unigene KOG注釋和分類

Fig.2KOG annotation and classification ofunigenes

2.6KEGG分類

對基因做KO注釋后，根據(jù)它們參與的KEGG代謝通路進行分類，將結(jié)果進行Pathway第一層分類，分為細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝過程和有機系統(tǒng)五大類；在此基礎(chǔ)上再進行Pathway第二層分類，共分為32類；在Pathway第二層分類下又分為270 個第三層分類，即KEGG pathway (表4)。結(jié)果顯示，在第一層分類中，代謝過程中注釋成功的Unigene數(shù)最多(5 553條)，KEGG pathway也最多(133類)；在第二層分類中KEGG pathway數(shù)最多的是信號傳導(dǎo)(24類)，而注釋成功的Unigene數(shù)最多的是翻譯過程(1 050條)。

2.7乙烯合成相關(guān)基因

乙烯是五大植物激素之一，有促進花和果實衰老以及呼吸躍變型果實成熟的作用。在植物體內(nèi)甲硫氨酸是乙烯合成的前體物，甲硫氨酸在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的催化下，轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM在ACC合酶催化下，成為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)，ACC在有氧條件下， 由ACC氧化酶催化形成乙烯。而CH3S-則通過甲硫氨酸循環(huán)保留在植物組織內(nèi)[11]。

KEGG通路分析顯示，與甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶、ACC合酶、ACC氧化酶有關(guān)的Unigene分別有11、12和3條(表5)。

表4　Unigene KEGG代謝途徑分類

表5　乙烯合成相關(guān)Unigene

3　討論

本實驗采用Illumina HiSeq2000 技術(shù)平臺對野生三葉木通果實6個不同時期樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過對數(shù)據(jù)的分析獲得三葉木通果實的Unigene 106 547 條，對基因功能注釋分類及代謝通路做了初步的解析，獲得了三葉木通果實中乙烯合成相關(guān)基因的序列信息。

在中藥領(lǐng)域已有大量藥用動植物進行了轉(zhuǎn)錄組測序，截止2014年已有超過40 種藥用動植物進行了轉(zhuǎn)錄組的研究[12]。張紹鵬等[13]對珠子參進行了轉(zhuǎn)錄組測序，確定了與三萜皂苷合成相關(guān)的候選基因。祁建軍等[14]對七葉一枝花進行了轉(zhuǎn)錄組測序研究，發(fā)現(xiàn)了在種子層積處理條件下胚芽與胚乳中的差異表達基因。魏麟等[15]對魚腥草進行轉(zhuǎn)錄組測序研究，發(fā)現(xiàn)了4 800個潛在的cDNA SSR分子標(biāo)記。

在李鐵柱等[10]對杜仲幼果和成熟果實的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，Q20值為94.08%，GC%值為47.39%。在金紅等[16]對楮頭紅轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，GC%和Q20分別為 52.59%和98.33%。在趙德剛等[17]對杜仲雌雄株轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，GC%為35.04%和33.61%，Q20為95.47%和96.01%。本試驗中GC%在94.08%到98.15%之間，Q20在43.20%到43.93%之間，與上述文獻比較認(rèn)為本次實驗所得三葉木通果實成熟過程中轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果質(zhì)量較好。

總的來說，本實驗得到的三葉木通果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)量較大、對比全面、數(shù)據(jù)質(zhì)量較好、具有進一步深入研究的科研價值。本實驗結(jié)果為研究三葉木通乙烯合成機制研究提供了參考，并為探究三葉木通果實成熟過程中基因表達情況以及三葉木通果實成熟基因的后續(xù)研究提供重要基礎(chǔ)。

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Transcriptome Analysis ofAkebiatrifoliatein Ripening Process

YANGHang1,LIUHong-chang2,SHIXiao-bing1,GEFei1,ZHAOZhi2*,LUOHui3

(1.CollegeoflifesciencesGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.CollegeofagricultureGuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 3.ForestryDepartmentofGuizhouProvincepopularizedterminal,Guiyang,Guizhou550001,China)

To reveal the gene regulation ofAkebiatrifoliateduring fruit ripening, Illumina HiSeq-2000 platform was recently employed for high-throughput sequencing of six fruit samples at different stages of fruit ripeness. Afterdenovoassembly and alignment, a total of 106,547 unigenes were obtained, including 27,302 and 12,014 hit the sequences deposited in Gene Ontology (GO) and Eukaryotic Orthologous Groups (KOG) databases, respectively. Additionally, 270 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) metabolic pathways were obtained for 11,749 unigenes, among which 26 involved in ethylene synthesis. The obtained results provided a basis for further investigation of gene regulation and key genes involving in fruit ripening of this species.

Akebiatrifoliate; Fruits; Transcriptome

2015-12-02；

2016-03-15

貴州省科技廳項目“木通仿生栽培研究與應(yīng)用示范”(黔科合SY字[2014] 3034-1號)；貴州省科技廳項目“貴州省林業(yè)廳青年人才基金項目”(黔林科合J字[2014] 08號)；貴州省科技廳項目“貴州省藥用植物繁育與種植人才基地”(黔人領(lǐng)發(fā)(2013)15號)。

趙致(1959-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：藥用植物育種、藥用植物代謝與藥材質(zhì)量控制；E-mail: zzhao@gzu.edu.cn。

Q37

A

1008-0457(2016)01-0046-06國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.009